紫外分光光度計

紫外分光光度計姓名：XX專業(yè)：生態(tài)學學號：2013XXX內(nèi)容提要紫外分光光度計概述紫外分光光度計的工作原理紫外分光光度計設(shè)備簡介紫外分光光度計的特點及吸收光譜紫外可見光譜分析法的應(yīng)用

分光光度計的進展一、紫外分光光度計概述（一）紫外分光光度計的原理

紫外分光光度計是一種常用的理化實驗室分析儀器，是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段?？梢栽谧贤饪梢姽鈪^(qū)任意選擇不同波長的光。物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結(jié)果。各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機和有機物質(zhì)的定性和定量測定。吸收光的波長范圍：200-800nm:(1)（近）紫外光區(qū):

200-400nm(2)可見光區(qū):400-800nm

(3)遠紫外區(qū)：10-200nm（二）紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生

1.分子吸收光譜的產(chǎn)生——由能級間的躍遷引起物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式：

（1）電子相對于原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動

分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級

三種能級都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量分子的內(nèi)能：電子能量Ee、振動能量Ev

、轉(zhuǎn)動能量Er即E＝Ee+Ev+Er

分子內(nèi)運動涉及三種躍遷能級，所需能量大小順序：ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

躍遷：電子受激發(fā)，從低能級轉(zhuǎn)移到高能級的過程。

分子只有選擇性的吸收(hν=△E)某些波長（頻率）的光才能由較低的能級躍遷到較高能級上。

若用一連續(xù)的電磁輻射照射樣品分子，將照射前后的光強度變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒂涗浵聛恚涂傻玫焦鈴姸茸兓瘜ΣㄩL的關(guān)系曲線，即為分子吸收光譜。2．紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生

由于分子吸收紫外-可見光區(qū)的電磁輻射，分子中價電子（或外層電子）的能級躍遷而產(chǎn)生紫外-可見吸收光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶，即帶狀光譜。（線狀光譜）（三）分光光度計發(fā)展概況1、1665年，牛頓曾做一個實驗：由暗室的小圓孔透過太陽光，形成了一細太陽束，光束再經(jīng)過棱鏡色散后，在墻壁上呈現(xiàn)了紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫的色帶,這色帶即被稱之為“光譜”。2、1760年郎伯(J.H.Lambert)發(fā)現(xiàn)物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的厚度成正比,后被稱之為郎伯定律。3、1852年比耳發(fā)現(xiàn)物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比,后被稱之為比耳定律。4、20世紀早期已經(jīng)有了商業(yè)化光譜儀,但光譜儀的微小型化趨勢開始于20世紀90年代初期。5、目前，在國內(nèi)外都已有了眾多的近紫外、可見光和近紅外波長范圍的微小型光譜儀的生產(chǎn)商。國外比較著名的有美國oceanoptiCS(海洋光學)公司、荷蘭AvanteSB.V.公司、日本島津公司、美國安捷倫公司、英國oxford工nstrumentS(牛津儀器)等等。國內(nèi)的產(chǎn)品主要有上海分析儀器總廠的75和76系列、上海棱光的551/2/3/4、天美科學儀器有限公司8500、北京普析通用儀器公司TUZ系列、北京瑞利分析儀器公司LJvl/9100系列、天津光學儀器廠的wFz系列等等。二、紫外分光光度計的工作原理1、吸光度和透光度設(shè)入射光強度為I0，吸收光強度為Ia,透射光強度為

It，反射光強度為Ir，則I0=Ia+

It+Ir由于反射光強度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為：

I0=Ia+

It透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之

比，用T表示：即T=It/I0吸光度:為透光度倒數(shù)的對數(shù)，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It2、朗伯-比爾定律

朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即A=κcl

式中比例常數(shù)κ與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。

紫外分光光度計的理論基礎(chǔ)是朗伯一比爾定律。儀器的工作原理為：（1）光源發(fā)出的光由聚光系統(tǒng)會聚后射向入射狹縫；（2）準直系統(tǒng)將來自入射狹縫的光會聚為平行光后射向光柵,光柵將復(fù)合光色散(使不同波長的光按照不同的角度出射)；（3）光譜聚焦系統(tǒng)將經(jīng)光柵色散的光聚焦使之成為按波長排列的光譜帶。（4）波長掃描機構(gòu)帶動光柵轉(zhuǎn)動，使從出射狹縫射出的單色光波長線性變化。（5）單色光經(jīng)過樣品池(樣品池是標準的比色皿樣品池，其中裝有被測樣品)被其中的樣品所吸收，最后到達光電倍增管(光電接收器)，經(jīng)過光電變換后輸出電信號。（6）電信號經(jīng)控制電路與信號處理電路后得到數(shù)字結(jié)果，數(shù)字結(jié)果經(jīng)過串行通訊傳送到計算機。（7）由計算機對數(shù)據(jù)進行處理得到光譜圖或各種光譜數(shù)據(jù)。3、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（2）溶液的不均性。實際樣品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點的吸光特性變化大。（3）光程的不一致性。光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。三、紫外分光光度計設(shè)備簡介紫外分光光度計盡管光度計的種類和型號繁多，但是它們都是由下列基本部件組成的：（一）基本組成部分1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。現(xiàn)多用碘鎢燈。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜?，F(xiàn)多用氘燈。

2.單色器

單色器是從連續(xù)光譜中獲得所需單色光的裝置。常用的有棱鏡和光柵兩種單色器。

棱鏡單色器的缺點是色散率隨波長變化，得到的光譜呈非均勻排列，而且傳遞光的效率較低。

光柵單色器在整個光學光譜區(qū)具有良好的幾乎相同的色散能力。因此，現(xiàn)代紫外-可見分光光度計上多采用光柵單色器。包括以下部分：

①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光：棱鏡或光柵；④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池，也可用石英池。要求：兩個的透光率相差要小于0.5％。玻璃360nm2.25mm石英200nm2.5mm吸收池的形狀波長范圍、使用注意事項：容易破碎可拆卸圓形測量池兩面透光圓形測量池兩面透光1cm長方形測量池兩面透光氣體測量池兩面透光微量測量池兩面透光流動測量池兩面透光4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理（二）分光光度計的分光類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。（三）影響紫外-可見吸收光譜的因素

物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等都可能發(fā)生變化。1.溫度

在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。2.溶劑

注意如下幾點：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3、pH效應(yīng)的影響

pH的改變可能引起共軛體系的延長或縮短，或引從而引起吸收峰位置改變。O-λmax235，287nmOHλmax211，270nmOH-H+四、紫外分光光度計的特點及吸收光譜1儀器設(shè)備和操作都比較簡單，價格

低，分析速度較快。2靈敏度較高。3有較好的選擇性。通過適當?shù)剡x擇測量條件，一般可在多種組分共存的體系中，對某一種物質(zhì)進行測定。（一）特點4精密度和準確度較高。在儀器設(shè)備和其他測量條件較好的情況下，其相對誤差可減小到1％一2％。

5用途廣泛。醫(yī)藥、化工、冶金、環(huán)境保護、地質(zhì)等諸多領(lǐng)域---已成為必不可少的測試手段之一。（二）吸收光譜1.物質(zhì)對光的選擇性吸收

物質(zhì)對光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)。通過測定被測物質(zhì)對不同波長的光的吸收強度（吸光度），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線。在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長λmax進行物質(zhì)含量的測定。2、有機化合物紫外-可見吸收光譜飽和烴及其取代衍生物

飽和烴類：只能產(chǎn)生*躍遷，最大吸收峰一般小于150nm。芳香族化合物E1、E2帶、B帶

苯環(huán)上有取代基時，三個吸收帶都長移，吸收強度也增大。B帶的精細結(jié)構(gòu)因取代基而變得簡單化。羰基化合物

產(chǎn)生*、n*、n*三個吸收帶。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。五、紫外可見光譜分析法的應(yīng)用紫外可見分光光度法定性分析對比吸收光譜的一致性對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對比吸光度(或吸光系數(shù))的比值定量分析單組分法吸光系數(shù)法校正曲線法對照法多組分法解方程組法雙波長法系數(shù)倍率法導(dǎo)數(shù)光譜法褶合光譜法結(jié)構(gòu)分析結(jié)