儀器分析-第一章紫外-可見分子吸收光譜法

第一章

紫外-可見分子吸收光譜法

Ultraviolet-VisibleMolecularAbsorptionSpectrometry,

UV-VIS

本次課應掌握的重點：1、什么是復合光、單色光、互補色光；2、物質(zhì)對光吸收的本質(zhì)是什么？3、為什么物質(zhì)對光會發(fā)生選擇性吸收？4、為什么分子吸收光譜是帶狀光譜而不是線狀光譜？5、什么是吸收曲線和最大吸收波長？§1-1概述

紫外-可見分子吸收光譜法(UltravioletVisibleMolecularAbsorptionSpectrometry,UV-VIS),又稱紫外-可見分光光度法(Ultraviolet-VisebleSpectrophotometry)。它是研究分子吸收190～780nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。紫外-可見吸收光譜主要產(chǎn)生于分子價電子的躍遷，通過測定分子對紫外-可見光的吸收，可以用于鑒定和定量測定大量的無機化合物和有機化合物。一.紫外光(ultravioletlight)

和可見光(visiblelight)光是一種電磁輻射（Electromagneticradiation)或叫電磁波(Electromagneticwave)能被人們看見的光稱為可見光。各種看不見的光，如紫外光、紅外光、X-射線、-射線等，它們也都是某一波長區(qū)域的電磁輻射。1.紫外光（ultravioletlight）

紫外光是指波長為10～380nm的電磁輻射，它又可分為遠紫外光（Farultravioletlight）和近紫外光（Nearultravioletlight）。遠紫外光的波長范圍是10～200nm。遠紫外光又有真空紫外光（Vacuumultravioletlight）之稱;近紫外光的波長范圍是200～380nm。2.可見光（visiblelight）

可見光是指波長范圍為380～780nm區(qū)域內(nèi)的電磁輻射。在這個區(qū)域內(nèi)，不同波長的光引起人的視覺神經(jīng)的感受不同，所以我們看到了各種不同顏色的光。例如，630～780nm的光是紅光，430～460nm的光是藍光等。

（1）復合光（Polychromaticlight）

與單色光（Single-colorlight）

如果讓一束白光通過三棱鏡，它將分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫七種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為光的色散（Chromaticdispersion）。我們把白光叫做復合光，把只具有一種顏色的光叫做單色光。（2）互補色光（Complementarylight）

從白光中分離出藍色后，剩余的混合光呈黃色，那么我們把黃光稱為藍色的互補色，同理，藍色也是黃色的互補色。如圖1-1所示，圖中，處于一條直線上的兩種單色光互為補色。三.吸光光度法的分類

吸光光度法按所用的和測量光的單色程度不同，可分為比色法和分光光度法。光的單色程度是指光的波長范圍的寬窄程度。1.比色法

（Colorimetricmethod）

比色法是指應用單色性較差的光與被測物質(zhì)作用建立起來的分析方法,它只能在可見光區(qū)使用。

(1).目視比色法

用眼睛比較溶液顏色的深淺，也就是說用眼睛作為溶液透過光的檢測器，從而確定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。例如：五價銻離子在pH=7時能與孔雀綠(

C23H25N2Cl

)形成綠色配合物：(2).光電比色法

光電比色法是利用光電轉(zhuǎn)換元件如光電池或光電管代替人眼作為檢測器。但在測定原理上與目視比色法是不同的，目視比色法是比較溶液透過光的強度，而光電比色法是檢測溶液對某一單色光的吸收程度，所用儀器叫光電比色計（Optimeter）。

2.分光光度法（Spectrophotometricmethods）

分光光度法在測定原理上與光電比色法是相同的，所不同的是獲得單色光的方法，前者采用濾光片,后者采用光柵或棱鏡,所用儀器叫分光光度計（SpectroPhoto-meter）。

§1-2吸收物質(zhì)

及其紫外和可見吸收光譜

一.吸收的一般性質(zhì)

1.吸收的本質(zhì)

光被物質(zhì)吸收，實際上就是光的能量轉(zhuǎn)移到了物質(zhì)的原子或分子中去了。光通過物質(zhì)后，某些頻率的光能使物質(zhì)的原子或分子由最低能級（基態(tài)）躍遷到較高的能級（激發(fā)態(tài)）。

量子化學表明：原子、分子或離子具有不連續(xù)的、數(shù)目有限的量子化能級，如圖1-2，所以，物質(zhì)只能吸收與兩個能級之差相同的或為其整數(shù)倍的能量。對于光來說，就是只能吸收一定頻率或波長的光。

即：

（1-1）

只有當照射光光子的能量hv與被照射物質(zhì)微粒的基態(tài)、某一激發(fā)態(tài)能量之差相當時才能發(fā)生吸收。

不同的物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同，則有不同的量子化能級，其能級之間的能量差是不同的，所以，不同的物質(zhì)可以吸收不同波長的光，即：物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。2.分子吸收光譜

（MolecularAbsorptionSpectrum）

（1）產(chǎn)生及分類

紫外、可見光的能量與分子中價電子躍遷吸收的能量相適應，所以紫外-可見光譜屬于分子吸收光譜。

分子內(nèi)部的運動可分為價電子運動、分子內(nèi)原子在平衡位置附近的振動和分子繞其重心的轉(zhuǎn)動，則分子中存在三種能量，而三種能量都是量子化的，所以有三種能級存在于分子中，即電子能級Ee(ElectronicLevel)、振動能級Ev(VibrationalLevel)、和轉(zhuǎn)動能級Er(RotationalLevel)。

在這三種能量中，電子能級之間能量差最大，振動能級相差次之，轉(zhuǎn)動能級相差最小。

即：ΔEe>>ΔEv>>ΔEr電子能級躍遷所需的能量一般在1～20eV。如果是5eV,則由式（1-1）可計算相應的波長:

已知h＝6.624×10-34J·s＝4.136×10-15eV·s

c（光速）＝2.998×1010㎝·s-1

故:

可見，電子能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜主要處于紫外及可見光區(qū)（200～780nm）。這種分子光譜稱為電子光譜或紫外-可見光譜。振動能級的能量差一般在0.025～1eV之間。如果能量差是0.1eV，則它為5eV的電子能級間隔的2％，所以電子躍遷并不是產(chǎn)生一條波長為248nm的譜線,而是產(chǎn)生一系列的譜線，其波長間隔約為248nm

×2％≈5nm。在振動能級躍遷時還伴隨著轉(zhuǎn)動能級的躍遷。轉(zhuǎn)動能級的間隔小于0.025eV。如果間隔是0.005eV，則它為5eV的0.1％，相當?shù)牟ㄩL間隔是248nm×0.1％＝0.25nm。紫外及可見吸收光譜，一般包含若干譜帶系，不同譜帶系相當于不同的電子能級躍遷，一個譜帶系（即同一電子能級躍遷，如由能級A躍遷到能級B）含有若干譜帶，不同譜帶相當于不同的振動能級躍遷。同一譜帶內(nèi)又包含若干光譜線，每一條線相當于轉(zhuǎn)動能級的躍遷，它們的間隔如上所述約為0.25nm。一般分光光度計的分辨率，觀察到的為合并成較寬的譜帶，所以分子光譜是一種帶狀光譜。

與純振動能級之差ΔEv相適應的輻射是波長約為0.78～50μm的光，這種光在近紅外（包括中紅外）區(qū)，所以，當用紅外線照射分子時，則此能量不足以引起電子能級的躍遷，只能引起振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，這樣得到的光譜稱為紅外吸收光譜(Infraredabsorptionspectrum)。

如果用能量更低的遠紅外線和微波（50～300μm）照射分子，則只能引起轉(zhuǎn)動能級的躍遷，這樣得到的光譜稱為遠紅外光譜（Far-infraredspectrum）和微波譜（Microwavespectrum）。不同波長范圍的電磁波所能激發(fā)的分子和原子的運動情況如下表所示：

（2）吸收曲線

分子吸收光譜是一種帶狀光譜，這種帶狀光譜可以用吸收曲線來表示。將不同波長（wavelength）的光透過某一物質(zhì)，測量每一波長下物質(zhì)對光的吸收程度即吸光度（Absorbance），然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，即得到一條吸收曲線或稱為吸收光譜圖。圖中曲線I、II、III是Fe2+含量分別為0.0002mg·mL-1,0.0004mg·mL-1和0.0006mg·mL-1的吸收曲線。1,10-鄰二氮雜菲亞鐵溶液對不同波長的光吸收情況不同,對510nm的綠色光吸收最多，有一吸收高峰（相應的波長稱為最大吸收波長，用max表示）。對波長600nm以上的橙紅色光，則幾乎不吸收，完全透過，所以溶液呈現(xiàn)橙紅色。不同物質(zhì)其吸收曲線的形狀和最大吸收波長各不相同。

根據(jù)這個特性可用作物質(zhì)的初步定性分析。不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近吸光度隨濃度增加而增大。但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是吸光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。本次課應掌握的重點：1、什么是助色團、生色團？它們有什么區(qū)別？2、各類有機化合物在紫外-可見光區(qū)的特征吸收；3、K、R、E、B吸收帶分別是由哪些結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生的？哪條吸收帶常用于定量分析？§1-2吸收物質(zhì)

及其紫外-可見吸收光譜

一.吸收的一般性質(zhì)二.分子的紫外-可見吸收光譜

1.有機化合物的紫外-可見吸收光譜

（1）.有機化合物分子中電子躍遷的類型

在有機化合物分子中有幾種不同性質(zhì)的價電子：形成單鍵的電子稱為σ鍵電子；形成雙鍵的電子稱為

鍵電子；氧、氮、硫、鹵素等含有未成鍵的孤對電子，稱為n電子（或稱p電子）。當它們吸收一定能量ΔE后，這些價電子將躍遷到較高能級（激發(fā)態(tài)），此時電子所占的軌道稱為反鍵軌道，而這種躍遷同分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。這些躍遷可分成如下三類：Ⅰ.N→V躍遷：由基態(tài)軌道躍遷到反鍵軌道，包括飽和碳氫化合物中的σ→σ*躍遷以及不飽和烯烴中的π→π*躍遷（σ*、π*分別表示σ鍵電子、π鍵電子的反鍵軌道）。

Ⅱ.N→Q躍遷：是分子中未成鍵的n電子激發(fā)到反鍵軌道的躍遷，包括n→σ*、n→π*躍遷。Ⅲ.N→R躍遷：是σ鍵電子逐步激發(fā)到各個高能級，最后電離成分子離子的躍遷(光致電離)。Ⅳ.電荷遷移躍遷：電子從給予體向接受體躍遷。由上述可見，有機化合物價電子可能產(chǎn)生的躍遷主要為σ→σ*、n→σ*、n→π*及π→π*。各種躍遷所需能量是不同的，可用下圖表示。

由圖可見，各種躍遷所需能量大小為：

σ→σ*＞n→σ*≥π→π*＞n→π*

一般說來，未成鍵孤對電子較易激發(fā),成鍵電子中π電子具有較高的能級,而反鍵電子卻相反。因此，簡單分子中n→π*躍遷、配位場躍遷需最小的能量，吸收帶出現(xiàn)在長波段方向，n→σ*、π→π*及電荷遷移躍遷的吸收帶出現(xiàn)在較短波段，而σ→σ*躍遷則出現(xiàn)在遠紫外區(qū)。

(2).有機物分子的紫外-可見吸收光譜

現(xiàn)根據(jù)電子躍遷討論有機化合物中較為重要的一些紫外吸收光譜，由此可以看到紫外吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系。Ⅰ.飽和烴及其取代衍生物

飽和單鍵碳氫化合物只有σ鍵電子，σ鍵電子最不易激發(fā)，σ→σ*躍遷產(chǎn)生的吸收一般在遠紫外區(qū)（10～200nm）。但由于這類化合物在200～1000nm范圍內(nèi)無吸收帶，在紫外吸收光譜分析中常用作溶劑（如己烷、庚烷、環(huán)己烷等）。當飽和單鍵碳氫化合物中的氫被氧、氮、鹵素、硫等雜原子取代時，吸收峰向長波長方向移動,這種現(xiàn)象稱為深色移動或稱紅移(batho-chromicshift),此時產(chǎn)生n→σ*躍遷。例如甲烷一般躍遷的范圍在125～135nm，碘甲烷（CH3I）的吸收峰則處在150～210nm（σ→σ*躍遷）及259nm（n→σ*躍遷）：

CH2I2及CHI3的吸收峰則分別是292nm及349nm(n→σ*躍遷)。這種能使吸收峰波長向長波長方向移動的雜原子基團稱為助色團（auxochrome）。如－NH2，－NR2,－OH，－OR,－SR，－Cl，－Br，－I等等。

Ⅱ.不飽和脂肪烴這類化合物如乙烯、丁二烯，它們含有π鍵電子，吸收能量后產(chǎn)生π→π*躍遷。若在飽和碳氫化合物中，引入含有π鍵的不飽和基團，將使這一化合物的吸收峰出現(xiàn)在紫外及可見區(qū)范圍內(nèi)，這種基團稱為生色團(chromophore)。生色團是含有π→π*或n→π*躍遷的基團,如:C=C、C≡C、C=N、C=O、N=N等。

具有共軛雙鍵的化合物如：共軛二烯、α,β-不飽和酮、α,β-不飽和酸、多烯、芳香核與雙鍵或羰基的共軛等等，由于π－π共軛效應生成大π鍵。使各能級間的距離較近（鍵的平均化），所以吸收峰的波長就增加，生色作用大為加強。例如乙烯的λmax為171nm(ε＝15530L?mol-1?cm-1)；丁二烯（CH2=CH-CH=CH2）吸收峰發(fā)生深色移動（λmax＝217nm），吸收強度也顯著增加（ε＝21000L?mol-1?cm-1）。

由于共軛雙鍵中π→π*躍遷所產(chǎn)生的吸收帶稱為K吸收帶。

特點：1、強度大，摩爾吸光系數(shù)εmax通常在10000～200000（＞104）L?mol-1?cm-1之間；2、吸收峰位置（λmax）一般處在近紫外及可見光范圍內(nèi)。K吸收帶的波長及強度與共軛體系中共軛雙鍵的數(shù)目等有關(guān)。共軛雙鍵愈多，深色移動愈顯著．據(jù)此可以判斷共軛體系的存在情況，這是紫外吸收光譜的重要應用。K吸收帶還常用于定量分析。Ⅲ.羰基化合物

羰基化合物含有基團，主要可以產(chǎn)生n→σ*,n→π*及π→π*三個吸收帶。n→π*吸收帶又稱R帶，落于紫外光區(qū)（270～350nm）。它的特點是強度低(εmax為10～20)，并且譜帶略寬，是羰基化合物的特征吸收帶。當醛、酮的羰基與雙鍵共軛時，形成了,-不飽和醛酮類化合物。由于羰基與乙烯基共軛，即產(chǎn)生π－π共軛作用，使π→π*和n→π*吸收帶向紅移動，前一吸收帶強度高(εmax

104)，后一吸收帶強度低(εmax<102)。這一特征可以用來識別,-不飽和醛、酮。

乙酰苯的紫外吸收光譜（正庚烷溶劑）：由于乙酰苯中的羰基與苯環(huán)的雙鍵共軛，因此可以看到很強的K吸收帶（lgε＞4）。另外，還出現(xiàn)R吸收帶及苯環(huán)的B吸收帶。Ⅳ.苯及其衍生物

苯在185nm（ε=47000）和204nm(ε=7900)處有兩個強吸收帶，分別稱為E1和E2吸收帶，是由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀共軛系統(tǒng)的躍遷所產(chǎn)生的。若苯環(huán)上有助色團如－OH、－Cl等取代，由于n-π共軛，使E2吸收帶向長波方向移動，一般在210nm左右；若有生色團取代而且與苯環(huán)共軛（π－π共軛），則E2吸收帶與K吸收帶合并且發(fā)生深色移動。除此之外，在230～270nm處（256nm處ε=200）還有較弱的一系列精細結(jié)構(gòu)吸收帶，稱為B吸收帶，這是由于π→π*躍遷和苯環(huán)的振動的重疊引起的。

如果對位二取代苯的一個取代基是推電子基團，而另一個是拉電子基團，深色移動就非常大。例如：Ⅴ.稠環(huán)芳烴及雜環(huán)化合物

稠環(huán)芳烴，如萘、蒽、菲等，均顯示苯的三個吸收帶，但這三個吸收帶均發(fā)生紅移，且強度增加。隨著苯環(huán)數(shù)目增多，吸收波長紅移越多，吸收強度也相應增加。當芳環(huán)上的―CH基團被氮原子取代后，則相應的氮雜環(huán)化合物(如吡啶、喹啉、)的吸收光譜，與相應的碳環(huán)化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與萘相似。此外，由于引入含有n電子的N原子，這類雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生n→π*吸收帶，如吡啶在非極性溶劑的相應吸收帶出現(xiàn)在270nm處(εmax=450L?mol-1?cm-1)。Ⅵ.吸收光譜的應用

1.官能團的檢出根據(jù)化合物的紫外及可見光區(qū)吸收光譜可以推測化合物所含的官能團。例如一化合物在220～800nm范圍內(nèi)無吸收峰，它可能是脂肪族碳氫化合物，不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系，沒有醛、酮或溴、碘等基團。

如果在210～250nm有強吸收帶，可能含有二個雙鍵的共軛單位；在260～350nm有強吸收帶，表示有3～5個共軛單位。

如化合物在270～350nm范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰很弱（ε=10～100）而無其它強吸收峰，則說明只含非共軛的、具有n

電子的生色團，如。

如在250～300nm有中等強度吸收帶且有一定的精細結(jié)構(gòu)，則表示有苯環(huán)的特征吸收。

2.同分異構(gòu)體的判別

例如乙酰乙酸乙酯存在下述酮-烯醇互變異構(gòu)體：

又如1,2-二苯乙烯具有順式和反式兩種異構(gòu)體：反式：λmax=295nmεmax=27000順式：λmax=280nmεmax=10500例1.苯酰丙酮在乙醚和在水中的UV光譜圖如下圖所示，解釋該化合物在不同溶劑中的主要存在形式及吸收峰歸屬。

解：由圖可知：苯酰丙酮在乙醚中(1)主要以烯醇式存在，因為在300nm處存在強的K吸收帶（紅移），前一吸收帶屬苯環(huán)的B吸收帶。在水中(2)主要以酮式存在，在250nm處也有較強的K吸收帶，300nm處的吸收是其中烯醇式的K吸收帶（紅移）。

例2.由紅外光譜得知某化合物含苯環(huán)、酮羰基、甲基、亞甲基。分子式為C9H10O，UV數(shù)據(jù)為：245nm(lgε=4.1)，280nm(lgε=3.1)，320nm(lgε=1.9)，確定化合物結(jié)構(gòu)并說明吸收峰屬于什么吸收帶？

由UV數(shù)據(jù)可進一步確定其結(jié)構(gòu)：245nm處強吸收峰屬于π→π*躍遷（共軛體系）的K吸收帶與E2帶合并的吸收帶。

280nm處的中等強度吸收屬于苯環(huán)的B吸收帶。320nm處的弱吸收屬于羰基結(jié)構(gòu)的R吸收帶（n→π*）解：由紅外官能團的確定，可知其結(jié)構(gòu)應為：本次課應掌握的重點：1、溶劑極性及酸度對有機化合物的紫外吸收光譜有何影響？２、無機化合物有哪些類型的躍遷吸收？哪種常用于定量分析？3、什么是透光度、吸光度、吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)？朗伯-比爾定律的物理意義是什么？§1－2吸收物質(zhì)及其紫外和可見吸收光譜

二.分子的紫外-可見吸收光譜

1.有機化合物的紫外-可見吸收光譜

Ⅶ.溶劑對有機物紫外吸收光譜的影響a.極限波長極限波長即溶劑在紫外光區(qū)產(chǎn)生吸收的最大波長。如果我們的測定在溶劑的極限波長以下（小于極限波長），則溶劑本身的吸收將影響測定，所以測定只能在極限波長以上進行。b.溶劑極性的影響

極性溶劑往往對吸收峰的波長、強度及形狀產(chǎn)生影響。比如，對于n→π*躍遷來說，溶劑極性增大，溶質(zhì)吸收峰產(chǎn)生藍移，而π→π*躍遷吸收峰產(chǎn)生紅移。c.溶劑酸度的影響對于具有酸堿性的被測物質(zhì)，溶劑的pH變化，則溶質(zhì)的存在形式發(fā)生變化，使分子中共軛效應發(fā)生變化，則使吸收紅移或藍移。如酚酞指示劑：

以上結(jié)構(gòu)變化也可以簡單地表示為：

無色分子無色離子紅色離子無色離子

根據(jù)測定，當pH＜8時，呈無色pH＞10時，呈紅色pH＞12時，呈無色2.無機化合物的紫外-可見吸收光譜(1).電荷遷移躍遷許多無機配合物如過渡金屬離子與含生色團的試劑反應所生成的配合物，吸收光子后能使中心離子與配位體間發(fā)生電荷遷移，即電子由配位體的軌道躍遷到中心離子的相關(guān)軌道上去。Mn+―Lb-M(n-1)+―L(b-1)–過渡金屬離子與含生色團的試劑反應所生成的配合物以及許多水合無機離子，均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷。如：

C1-(H2O)nC1(H2O)n-[Fe3+SCN-]2+[Fe2+SCN]2+

若中心離子的氧化能力愈強，或配位體的還原能力愈強，則發(fā)生電荷遷移躍遷時所需能量愈小，吸收光波長紅移。電荷遷移吸收光譜譜帶最大的特點是摩爾吸光系數(shù)較大，一般εmax

104。(2)配位場躍遷配位場躍遷包括d－d躍遷和f－f躍遷。元素周期表中第四、五周期的過渡金屬元素分別含有3d和4d軌道，鑭系和錒系元素分別含有4f和5f軌道。在配位體的存在下，過渡元素五個能量相等的d軌道及鑭系和錒系元素七個能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道及f軌道。當它們的離子吸收光能后，低能態(tài)的d電子或f電子可以分別躍遷至高能態(tài)的d或f軌道上去。由于這兩類躍遷必須在配位體的配位場作用下才有可能產(chǎn)生，因此又稱為配位場躍遷。①稀土元素化合物的吸收（f-f

躍遷）

大多數(shù)稀土元素對紫外-可見光可產(chǎn)生吸收,這是由于這些元素的原子中都有未充滿的f軌道，吸收紫外-可見光將使電子在f軌道的不同能級上躍遷。不同的稀土元素吸收光譜差別很大，所以常用分光光度法來分析鑒定這些離子。②

過渡金屬離子化合物的吸收

（d-d躍遷）

過渡金屬離子化合物大多是有顏色的，一般認為是由于過渡金屬元素有未充滿的d軌道，電子可以在能級不同的d軌道之間躍遷，其能量差相當于紫外-可見光區(qū)的能量，即d-d躍遷。所以，過渡金屬元素的離子（嚴格說是它的水合離子）可以吸收紫外-可見光。§1-3吸收定律

1.朗伯-比耳定律

（theBeer-LambertLaw）

光吸收的基本定律是朗伯-比耳定律，這個定律是比色分析和分光光度法的定量依據(jù)。

（1）溶液對光的形為及有關(guān)術(shù)語

溶液對光的形為是一部分光被吸收，一部分光被界面反射，其余的光則透過溶液。

即入射光強度I0可表示為：I0=I

t+I

a+I

r上式中，I

a為吸收光的強度，I

t為透射光的強度，I

r為反射光的強度。

溶液對光的反射損失很小，可以忽略不計，則當一束平行單色光照射溶液時，一部分光被溶液吸收,其余的光透過溶液。我們把透射光強度與入射光強度的比值稱為透光度或透光率(Transmittance)，用“T”表示。則：T＝It/I0

T還常用百分透光率表示：T％＝T×100％溶液對光的吸收程度常用吸光度（Absorbance）表示，符號為“A”。

A的定義為：吸光度等于透光度的負對數(shù)或透光度倒數(shù)的對數(shù)。即：

A=-lgT=lg=lg

T和A都是用來表征入射光被吸收程度的一種量度。

溶液的吸光程度與該溶液的濃度、液層厚度以及入射光的強度有關(guān)，如果保持入射光強度不變，則光吸收程度就只與溶液濃度和液層厚度有關(guān)。描述它們之間定量關(guān)系的定律稱為朗伯-比耳定律，這個定律是由朗伯定律和比耳定律兩個定律組成的。

（2）朗伯定律（LambertˊsLaw）

朗伯定律是德國物理學家J.H.Lambert于1760年提出的。朗伯定律：如果溶液的濃度一定，則光的吸收程度與液層的厚度成正比。即：A=lg=k1b(濃度c一定)式中：k1－比例系數(shù)

b－液層厚度或叫光程長度

D（3）比耳定律（BeerˊsLaw）

比耳定律是由德國物理學家A.Beer于1852年研究發(fā)現(xiàn)的，比耳研究了各種無機鹽水溶液對紅光的吸收，從而得出這樣一個結(jié)論：當單色光通過液層厚度一定的溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。這就是比耳定律的內(nèi)容。表示式為：

A=lg=k2c（b一定）式中：c－溶液濃度k2－比例常數(shù)D

從上面兩個定律的表示式可以知道，當c、b變化時，A將與兩者乘積成正比，即朗伯-比耳定律的數(shù)學表示式為：

A=a·b·c……(1)a稱為吸光系數(shù)（Absorptivity）。如果液層厚度用“㎝”表示，濃度以“g·L-1”為單位，則a的單位是“L·g-1·㎝-1”。通常濃度以“mol·L-1”為單位,此時的吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)（Molarabsorptivity),用“ε”表示,單位：“L·mol-1·㎝-1”，所以朗伯-比耳定律也可以表示為：

A=ε·b·c……(2)（1）、（2）兩式是朗伯-比耳定律的數(shù)學表示式。它的物理意義是：當一束平行單色光通過單一均勻的、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。

ε稱為摩爾吸光系數(shù)，它表示物質(zhì)的量濃度為1mol·L-1,液層厚度為1㎝時溶液的吸光度。

ε反映吸光物質(zhì)對光的吸收能力，也反映用吸光光度法測定該吸光物質(zhì)的靈敏度,是選擇顯色反應的重要依據(jù)。從ε和a的單位可看出，兩者的換算關(guān)系為：

ε=M·a（M是摩爾質(zhì)量）例：已知含Cd2+濃度為140g·L-1的溶液，用雙硫腙比色法測定Cd,比色皿厚度為2㎝，在λ=520nm處測得的吸光度為A=0.220，計算該配合物的a和ε。

解：根據(jù)定律：

a=A/(b·c)=0.220/(2×140×10-6)

=786(L·g-1·㎝-1)Cd的原子量為112，則：ε=M·a=112×786=8.80×104(L·mol-1·㎝-1)在多組分體系中，如果各組分對光都有吸收，并且它們之間無相互作用，這時體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，也就是說，吸光度具有加和性：

A總=A1+A2+…+An

=ε1·b·c1+ε2·b·c2+…+εn·b·cn

本次課重點：1、紫外-可見分光光度計的結(jié)構(gòu)及各部分作用原理如何？2、光度分析法的誤差來源主要有哪些？如何減免？3、雙波長分光光度法的測定原理是什么？4、紫外-可見分光光度法在食品分析中的應用?！?-4分析儀器的基本部件

光度分析所用的儀器叫光度計，因為光度分析包括光電比色法和分光光度法兩種方法，這兩種方法所用的儀器分別稱為光電比色計和分光光度計。

分光光度計有72、721型等，這些都是用于可見光區(qū)的，波長范圍為400～800nm，另外，751型、751G型分光光度計可用于紫外和可見光區(qū)，波長：200～1000nm。希爾格HilgerH-700，UnicamSP-500型，島津QR-50型等。WFD-G型紫外-可見光度計是采用光柵單色器。儀器一.光源（Source）

光源是提供符合要求的入射光的裝置，作為光源必須滿足三個條件：1.必須能夠產(chǎn)生具有足夠強度的光束。2.發(fā)出光的強度要穩(wěn)定。3.光源提供的波長范圍應能滿足分析的要求；常用的可見光光源是鎢絲燈，它可發(fā)射320～2500nm范圍的連續(xù)光譜，包括了可見光區(qū)和近紅外光區(qū)。常用的紫外光源是氫燈或氘燈，它可發(fā)射的波長范圍是180～375nm。二.單色器（Monochromater）

將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，稱為單色器。單色器由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡等組成。此外，常用的濾光片也起單色器的作用。棱鏡單色器的原理：

光通過入射狹縫，經(jīng)透鏡以一定角度射到棱鏡上，在棱鏡的兩界面上發(fā)生折射而色散，后被聚焦在一個帶有出射狹縫的表面上，移動棱鏡或移動出射狹縫的位置，就可使所需波長的光通過狹縫照射到試液上。使用棱鏡等單色器可以獲得純度較高的單色光(半寬度5～10nm)。

三.吸收池（Absorptioncell）

吸收池也稱比色皿，是用于盛裝試液并決定溶液液層厚度的器皿。比色皿一般是長方體形，有兩個側(cè)面是光學玻璃制成的透光面，這兩個透光面之間的距離就是光程長度。另兩個側(cè)面是毛玻璃面。四.信號檢測器（Signaldetector）

測量吸光度時，由于A=lg（I0/It）,入射光強度I0是一定的，則A與It之間有固定的函數(shù)關(guān)系。但在測量吸光度時，并不是直接測量透過吸收池的光強度，而是把光強度轉(zhuǎn)化成電信號進行測量，這種光電轉(zhuǎn)換器件就稱為檢測器。

實際上廣泛使用的光電轉(zhuǎn)換器是光電管（Phototube）、或光電倍增管（Photomultipliertube）。它們作為光電轉(zhuǎn)換器的原理都是：當光子照射時，可以發(fā)射電子而產(chǎn)生電流，電流的大小與照射光強度成正比。

光電管響應的光譜范圍和靈敏度取決于沉積在陰極上材料的性質(zhì)。例如：氧化銫-銀對近紅外光區(qū)敏感，氧化鉀-銀和銫-銀最敏感的范圍在紫外和可見光區(qū)。由于熱電子發(fā)射，光電管會產(chǎn)生暗電流。五.信號顯示器（Signaldisplaysystem）

信號顯示器是將光電轉(zhuǎn)換器輸出的信號顯示出來的裝置。1.直讀式通常是一個檢流計（微安表或毫安表）,由它來測量光電流的大小，測出的光電流再以吸光度A或T%的形式反映到表盤上。

2.電位調(diào)節(jié)指零型裝置

3.數(shù)字顯示型美國HACH公司的DR/4000UV-VIS分光光度計§1-5光度分析法的誤差

吸光光度法的誤差主要來自兩方面:一是偏離朗伯-比爾定律；二是吸光度測量引起的誤差。

一.對朗伯-比爾定律的偏離

在固定液層厚度及入射光的波長和強度的情況下，測定一系列標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標作圖，應得到一條通過原點的直線，該直線稱為標準曲線或工作曲線。在相同情況下測得試液的吸光度，從工作曲線上就可以查得試液的濃度，這就是工作曲線法。

偏離比爾定律的主要原因是目前儀器不能提供真正的單色光（由同一波長的光子組成的光），目前儀器所提供的入射光實際上是由波長范圍較窄的光帶組成的復合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，因而引起了對比爾定律的偏離。

假設(shè)入射光由兩種波長λ1和λ2的光組成，比爾定律分別在這兩種波長下是適用的。對λ1（入射光強為I0′）吸光度為A′,摩爾吸光系數(shù)為ε1，則：A′=lg(I0′/It1)＝ε1bc，It1

=I0′×10-ε1bc

對于λ2（入射光強為I0"），吸光度為A〞,摩爾吸光系數(shù)為ε2，則A〞＝lg(I0〞/It2),It2

=I0〞×10-ε2bc測定時入射光強度為（I0′＋I0〞），透射光強度為（It1

+It2）,則所得吸光度值為：

或：實驗證明，若能選用一束吸光度隨波長變化不大的復合光作入射光來進行測定，由于ε變化不大，所引起的偏離就小，可得到較好的線性關(guān)系。

二.吸光度測量的誤差

在分光光度計中，透光度的刻度是均勻的，吸光度刻度是不均勻的。因此對于同一臺儀器，讀數(shù)的波動對吸光度來說不是定值。由光度計讀數(shù)標尺上吸光度與透光度的關(guān)系可以看出，吸光度越大，讀數(shù)波動引起的吸光度誤差也越大。檢流計標尺上A與T的關(guān)系透光度(或吸光度)在什么范圍內(nèi)具有較小的濃度測量誤差呢？若在測量吸光度A時產(chǎn)生了一個微小的絕對誤差dA，則測量A的相對誤差(Er)為:

根據(jù)朗伯-比爾定律:A=εbc當b為定值時，兩邊微分得到:dA=εbdcdc就是測量濃度c的微小的絕對誤差。二式相除得到:

A與T的測量誤差之間的關(guān)系如下:A=-lgT=-0.434lnT微分：

兩式相除：可見，由于A與T不是正比關(guān)系，則它們的測量相對誤差并不相等。于是，濃度c的測量相對誤差為:

由于T的測量絕對誤差是固定的，即dT=?T=±0.01