TSK-GEL色譜柱使用中的常見故障及故障排除(中文)100921

TSKGEL色譜柱使用中的常見問題及故障排除東曹（上海）生物科技有限公司TosohBioscienceShanghaiCo.,Ltd.2010.10尺寸排阻色譜(SEC/SW)離子交換色譜(IEC)疏水反應(yīng)色譜(HIC)親和色譜(AFC)反相色譜(RPC)正相色譜

(NPC/HILIC)保護(hù)柱FAQ內(nèi)容概要HPLCSECHICIECAFCBioAssist2SWXL,3SWXL,4SWXLBioAssist6PWTSKgelG2000SWXL,G3000SWXL,G4000SWXLBioAssistPhenylTSKgelPhenyl-5PW,Ether-5PWBioAssistChelateTSKgelChelate-5PW,Heparin-5PW,TSKgelBlue-5PW,ABA-5PWBioAssistQ,BioAssistSTSKgelDEAE-5PW,SuperQ-5PW,TSKgelSP-5PW,CM-5PWTSKgelDEAE-NPR,SP-NPR,DNA-NPRRPCTSKgelOctadecyl-2PW,-4PW,-NPRTSKgelPhenyl-5PWRPTSKgelODS-100V,ODS-100Z,ODS-100S,ODS-80Ts生物分離色譜柱-TSK-GELBioAssist系列及其他問題原因和解決辦法1樣品吸附太強(qiáng)難以被洗脫1樣品與色譜柱填料上的硅羥基發(fā)生離子性相互作用。

(a)將緩沖液中的離子強(qiáng)度增加至

0.3

(如;含有

0.3MNaCl的

50mM磷酸鈉緩沖液

,pH6.8）

(b)將pH值減少到5.5左右

(如;含有

0.1MNa2SO4的

50mM磷酸鈉緩沖液

,pH5.5)

2分子量大于300K的蛋白質(zhì)（或多聚體及二聚體）有可能發(fā)生非特異性吸附（疏水）。

(a)在實(shí)際分析之前先進(jìn)樣數(shù)次（總共上樣約1mg左右，如：質(zhì)粒樣品）

這種現(xiàn)象會發(fā)生在第一次使用新柱子時。

3疏水分子（如多肽）間發(fā)生疏水相互作用。

(a)在流動相中添加一些有機(jī)溶劑，如：乙腈(低于

50%)

(如;含有

40%乙腈的

50mM磷酸鈉緩沖液

,pH6.8)2樣品的洗脫越來越遲緩1在劣化的色譜柱填料上發(fā)生了離子相互作用。

(a)將緩沖液中的離子強(qiáng)度增加至0.5(0.5MNaCl),或降低緩沖液的pH值。

完全恢復(fù)色譜柱的功能是不可能的。

使用pH值小于7的緩沖液。

2發(fā)生疏水性吸附的雜質(zhì)造成色譜柱堵塞。

(a)參照操作手冊添加有機(jī)溶劑清洗色譜柱

(b)安裝保護(hù)柱并適時更換注;PW系列的色譜柱有時也會和SW系列一樣發(fā)生疏水性吸附的問題。故障排除：尺寸排阻色譜柱(SW)ConditionsColumn:TSKgelG3000SWXL(7.8mmI.D.x30cm)Eluent:A;0.3mol/LNaClin50mmol/Lsodiumphosphatebuffer,pH6.7B;0.1mol/LNa2SO4in50mmol/Lsodiumphosphatebuffer,pH5.0Flowrate:1.0mL/minTemperature:25CDetection:UV(280nm)*AllowsindicatealbuminpeaksSEC分離中的改進(jìn)的分辨率-流動相的影響

(pH)

另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。

峰高取決于平衡時間(雜質(zhì)含量)

鬼峰甚至重復(fù)出現(xiàn)在空白梯度的同一洗脫位置。

(a)使用高純度的溶劑

（phosphate,Tris,Guanidine/HCl等）

流動相中的離子性雜質(zhì)聚集并被洗出。1在線性梯度的同一洗脫位置重復(fù)出現(xiàn)鬼峰5(b)pH梯度應(yīng)該在由不同pH緩沖范圍的緩沖液組成的混合液中進(jìn)行

(匹配的;DEAE-5PW/amine-buffer,不匹配的;DEAE-5PW/phosphateoracetate)

(a)按照離子交換填料的官能團(tuán)選擇合適的緩沖液

（重現(xiàn)性非常不好）

緩沖液中的離子與填料基質(zhì)結(jié)合形成了離子對。1pH在入口和出口處不同，即很難平衡4(b)添加不會干擾結(jié)合的鹽(0.05-0.1MNaCl)

(a)濃縮樣品縮短上樣時間

這種情況發(fā)生在使用低鹽緩沖液上樣過程超過1個小時的時候

長時間的上樣過程中，樣品發(fā)生變性或疏水性吸附1當(dāng)上樣量放大后，回收率變低了3(b)使用有機(jī)溶劑清洗

(a)使用酸性溶液或堿性溶液進(jìn)行清洗

樣品中的疏水性雜質(zhì)吸附在填料上干擾了正常的結(jié)合1進(jìn)樣若干次后對樣品的吸附能力逐漸下降2(a)通過透析來對樣品溶液脫鹽處理

樣品溶液的pH值與緩沖液的不同2

特別是在下一步中將會使用疏水模式的樣品應(yīng)該按照以上方法處理

(a)通過透析或用緩沖液（非鹽緩沖液）來對樣品溶液脫鹽處理

樣品溶液中的離子強(qiáng)度太高1樣品吸附不夠充分1原因和解決方法問題故障排除：離子交換色譜(IEC)選擇合適的緩沖體系Column；TSKgelDEAE-5PW(7.5mmI.D.×7.5cm）Eluent；A:20mmol/lTris-HClbufferB:20mmol/lPhosphatebufferA→A+0.5mol/lNaCl（60minlineargradient）

B→B+0.5mol/lNaClFlowrate；1.0mL/minTemperature；AmbientDetection；pHmonitorPhosphatebuffer(difficulttorecovertoinitialpH)Tris-buffer(easytorecovertoinitialpH)DEAE-5PW:positivechargesTris:positive

chargesPhosphate:negativecharges在離子交換填料的洗脫出口處不穩(wěn)定的pH值不匹配的離子交換填料與緩沖液BioAssistQ10x10MethacrylatetypeCommercialQtype6mLStyrenetypePuritycheckofMabSamplesonTSKgelG3000SWXL00.511.522.533.505101520PeakareaofIgG19%PeakareaofIgG65%PeakareaofIgG80%BioAssistQ10x10FractionCommercialQ6mLFractionStocksolutionRetentiontime(min)使用大孔徑的IEC色譜柱純化蛋白質(zhì)單抗的分辨率大大改進(jìn)AIECBindingColumnsize(mmI.D.xmmHeight)

capacity*2x754.6x355x507.8x508x7510x10021.5x15022x200Columnvolume(ml)(mg/mlgel)

0.20.612485476DEAE-NPR3－0.6－－－－－－BioAssistQ84－－28-－221－－DEAE-5PW302－10-38－540－SuperQ-5PW937－31-118－1,674－DEAE-Toyopearl30－－10243879540760SuperQ-Toyopearl650130－－431041653422,3403,293QAE-Toyopearl550C70－－2356891841,2601,773結(jié)合載量是通過溶菌酶來計(jì)算的BioAssistS;4.6mmIDx50mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格AIEC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽

避免過載CIECBindingColumnsize(mmI.D.xmmHeight)

capacity*2x754.6x355x507.8x508x7510x10021.5x15022x200Columnvolume(ml)(mg/mlgel)

0.20.612485476SP-NPR5－1－－－－－－BioAssistS90－－30-－237－－SP-5PW544－18-68－972－CM-5PW484－16-61－864－SP-Toyopearl65050－－1740631329001,267SP-Toyopearl550C100－－33801272631,8002,533MegaCapSP-550EC108－－36861372841,9442,736CM-Toyopearl65040－－1332511057201,013結(jié)合載量是通過溶菌酶來計(jì)算的BioAssistS;4.6mmIDx50mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格CIEC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽

避免過載問題原因和解決辦法1樣品未被洗脫（吸附太強(qiáng)）1樣品與填料間的反應(yīng)太過強(qiáng)烈。

(a)使用疏水性相對較弱的柱子(如：

Ether-5PW替代Phenyl-5PW)

(b)添加5%的有機(jī)溶劑（異丙醇、乙醇等）或2M尿素于流動相中

2樣品在進(jìn)樣前發(fā)生沉淀。

(a)將硫銨的濃度降低到0.5M來確認(rèn)樣品的溶解性2樣品較早溶出并且峰形很寬1樣品溶液中的硫銨濃度太低。

(a)將樣品中的硫銨濃度增加到至少1M

(將等體積的樣品溶液與硫銨溶液混合)3基線不穩(wěn)1緩沖液試劑中的雜質(zhì)被梯度洗脫。

(出現(xiàn)鬼峰)

(a)使用高純度的試劑(酶純化級別的試劑).

鬼峰甚至重復(fù)出現(xiàn)在空白梯度的同一洗脫位置。

峰高取決于平衡時間(雜質(zhì)含量)

另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。

注;

第一次嘗試時推薦首選

Phenyl-5PW色譜柱（可在較寬范圍內(nèi)吸附蛋白樣品

）

有些蛋白因?yàn)樘盍系氖杷蕴醵荒鼙籈ther-5PW吸附。

對于HIC，在使用前可以先將流動相過濾，因?yàn)橛袝r試劑中會含有一些沉淀物。故障排除：疏水反應(yīng)色譜(HIC)Column;TSKgelPhenyl-5PW7.5mmI.D.x7.5cmElution;A60minlineargradientofammoniumsulfatefrom1.5Mto0in0.1Mphosphatebuffer(pH7.0)ataflowrateof1.0ml/min,detectedbyUVabsorbanceat280nmWeakretentionpeakmaybeelutedearlierandbroaderunlesssamplecontainsmin.0.5Mammoniumsulfate.Dissolvesamplewithbuffercontainingmin.0.5Mammoniumsulfate(Dilutesampleequallywithbuffercontainig1.5Msalt)峰形展寬

HIC對樣品的分離效果HICBinding

Columnsize(mmI.D.xmmHeight)

capacity*2x754.6x355x507.8x508x7510x10021.5x15022x200Columnvolume(ml)(mg/mlgel)

0.20.612485476Butyl-NPR5－1－－－－－－Ether-5PW201.6－7－25－360－BioAssistPhenyl-5PW252－8203266450－Ether-Toyopearl65031－－102539－558785PPG-Toyopearl60035－－12284492630887Phenyl-Toyopearl65039－－133149103702988Butyl-Toyopearl65040－－1332511057201,013SuperButyl-Toyopearl550C52－－1742661379361,317Hexyl-Toyopearl65040－－1332511057201,013BioAssistPhenyl;4.6mmIDx50mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格HIC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽

避免過載色譜柱問題原因和解決辦法Chelate-5PW1樣品的吸附很弱1金屬離子鍵合量過低或鍵合了不匹配的金屬離子。

(a)注入用蒸餾水溶解后的金屬離子。

(b)使用銅離子(Cu2+)來代替鋅離子(Zn2+)。

2樣品的吸附逐漸變?nèi)?分離時金屬離子脫落。

(a)對于鋅離子，每次上樣后都要使用EDTA來清洗和再生。

(b)對于銅離子，每上5次樣后都要使用EDTA來清洗和再生。

2流動相緩沖液與填料上的金屬離子發(fā)生螯合。

(a)避免使用氨衍生緩沖液如Tris、檸檬酸鹽緩沖液。

3樣品吸附太強(qiáng)1金屬離子與樣品間的相互作用太強(qiáng)。

(a)使用螯合能力相對較弱的金屬離子，如：鋅或鎳

(b)具有很強(qiáng)吸附能力的樣品可以使用20mMEDTA+0.5MNaCl來稀釋。

2樣品發(fā)生了離子交換作用而不是螯合作用。

(a)向流動相緩沖液中加鹽(0.5MNaCl)。Boronate-5PW1樣品的吸附很弱1推測可能是二硫鍵不夠穩(wěn)定。(a)向吸附緩沖液中添加10mM的MgCl2。Tresyl-5PW目標(biāo)分子的吸附載量與通過固定配體含量來預(yù)測的數(shù)字相比，顯得特別低1配體蛋白變性，不能按照正常的AFC多位點(diǎn)吸附來進(jìn)行。(a)縮短配對時間。(b)使用高濃度的配體溶液來配對。故障排除：親和色譜(AFC)問題原因和解決辦法1基線不穩(wěn)定1由水中或試劑中的有機(jī)雜質(zhì)所引起。

(a)使用超純蒸餾水或HPLC級別的蒸餾水。

(b)在使用前先將流動相在ODS柱上流過過濾。

2脫氣不充分

(與設(shè)備相關(guān))

(a)在使用前脫氣或使用脫氣溶劑。TFA在脫氣后加入。

（出現(xiàn)鬼峰）3流動相中的TFA發(fā)生降解。

(a)在分析前現(xiàn)配TFA溶液。2即使使用空白梯度，在線性梯度的同一洗脫位置1流動相中的疏水性雜質(zhì)富集并被洗脫。

重復(fù)出現(xiàn)鬼峰

(a)使用高純度的試劑，（如磷酸、硫酸鹽、TFA等）

鬼峰面積隨著平衡時間的增加，雜質(zhì)富集而增加。

另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。

3樣品在高碳含量的ODS柱中保留不好1固定相在低有機(jī)溶劑濃度(<50%)的環(huán)境中作用并不是很充分。（流動相含水量高)

(a)使用單層鍵合含碳量較低的(15%)的ODS柱，如：ODS-80Ts。

(b)使用正相色譜來代替。4離子性樣品洗脫的重現(xiàn)性不好1流動相的pH值與離子性樣品的pKa值很接近。

(a)使用與樣品pKa值相差1.5以上的流動相pH值。5樣品的保留不好1樣品用有機(jī)溶劑溶解后加速了洗脫。

(樣品洗脫呈2個峰但峰形很寬）

(a)至少使用與洗脫液開始濃度的有機(jī)溶劑、或與其濃度相仿的有機(jī)溶劑來溶解樣品。

故障排除：反相色譜

(RPC)-(1)問題原因和解決辦法6多肽樣品保留不好1填料的疏水性太弱。

(a)使用硅膠基質(zhì)的ODS柱代替樹脂基質(zhì)的反相柱。

(b)添加離子對試劑，如：

TFA(0.2%)

(出峰太快）2流動相的重新平衡不充分

(a)使用不含有機(jī)溶劑的流動相來平衡至少需要1個小時來得到重復(fù)性好的譜圖。即使使用

分析柱時也一樣。7蛋白質(zhì)樣品的吸附很弱1樣品溶液中的蛋白質(zhì)變性不充分。

(a)用最初的流動相(如：0.05%TFA)來溶解或稀釋蛋白樣品并促成蛋白變性。

(b)增加離子對試劑的濃度，如：大于

0.05%的TFA8蛋白或多肽樣品不能充分洗脫（吸附太強(qiáng)）1填料與樣品的作用太強(qiáng)了。

(a)降低離子對試劑的濃度，如：低于0.02%的TFA

(b)提高流動相的

pH值。(根據(jù)

pH的變化，選擇性也會發(fā)生變化)

對于ODS柱，

用

50mM的磷酸緩沖液將pH提高到7.0

對于樹脂基質(zhì)的柱子，用50mM的Na2HPO4將pH提高到9.5

(蛋白或多肽的回收率很低)2色譜柱填料的孔徑太小了

(或疏水性太強(qiáng))

(a)使用更大孔徑的柱子，如：

TSKgelPhenyl-5PWRP故障排除：反相色譜

(RPC)-(2)Column:TSKgelODS-100V(4.6mmI.D.x15cm)Eluent:A;10mMNaH2PO4/CH3CN=85/15B;10mMNaH2PO4/CH3CN=30/70Gradient:0min(B;0%)→15min(B;75%)Flowrate:1.0mL/minDetector:UV(265nm)Injectionvol.:20μLConcentration:10μg/LColumntemp.:40℃1:sulfisomidine2:sulfamerazine3:sulfamethoxazole4:sulfaquinoxalinemethanol100%methanol70%methanol30%methanol10%1234樣品溶液中的有機(jī)溶劑濃度應(yīng)當(dāng)不高于初始流動相中有機(jī)溶劑的濃度SlightpeakbroadeningSeriouspeakbroadeningBadpeakshape峰形展寬

(1)

RPC下樣品溶液中不同濃度有機(jī)溶劑的影響比較Column;TSKgelODS-80Ts(2mmI.D.x15cm)Elution;A30minlineargradientofacetonitrilefrom0to70%in0.1%TFAataflowrateof0.2ml/min,detectedbyUVabsorbanceat215nm.除非經(jīng)過充分并且正確的平衡(10-20個柱體積的平衡)，否則這些峰的洗脫是沒有重復(fù)性的。

Gradientelution;Initial;0%Final;70%acetonitrile峰形展寬

(2)

RPC下重現(xiàn)性良好的多肽消化物的分離Column;TSKgelPhenyl-5PWRP4.6mmI.D.x7.5cmElution:A44minlineargradientofacetonitrilefrom5%to60%in0.02%TFAataflowrateof1.0ml/min,detectedbyUVabsorbanceat220nmCasterBeanLectin(RCA)對于保留很強(qiáng)的蛋白質(zhì)：

大孔徑的填料:100nm

低離子對試劑濃度:0.02%(流動相的pH:酸性到中性)RPC保留太強(qiáng)、回收率很低

大孔徑填料和離子對試劑的影響問題原因和解決辦法1樣品的吸附不充分1有機(jī)溶劑濃度太低（流速太快）。

(a)用含有高濃度有機(jī)溶劑的溶液來溶解樣品。

但是，要注意防止樣品在溶液中發(fā)生沉淀。

(b)減少樣品的進(jìn)樣量。

2進(jìn)樣量太大。

(a)進(jìn)樣量小于50微升（小于

200微克)。2在Amide-80柱上，同一樣品洗脫出2個峰1在Amide型色譜柱上分離出了樣品的異構(gòu)體

(Amide-80)。

(a)在

80℃下進(jìn)行分析以消除異構(gòu)體的影響。(b)

添加100mM的三乙胺

。(不需要升高分析溫度)(c)使用NH2型色譜柱。3使用NH2型色譜柱時，還原性多糖的回收率很低1樣品與填料基質(zhì)上的Shiff's堿發(fā)生作用。(a)使用Amide型色譜柱(Amide-80)。

故障排除：正相色譜(NPC,HILIC)更換保護(hù)柱1使用保護(hù)柱或保護(hù)膠來保護(hù)分析柱。2發(fā)生問題時，

檢查一下是否可以通過更換保護(hù)柱來解決問題。3用高純度（過濾后的）標(biāo)準(zhǔn)品來驗(yàn)證柱效，檢查有無保護(hù)柱時譜圖是否發(fā)生變化。4如果問題的發(fā)生僅是因?yàn)楸Ｗo(hù)柱，那么更換保護(hù)柱后，柱效問題就能得到修復(fù)。更換保護(hù)柱外的故障排除癥狀原因故障排除正常峰形，不溶物堵住了柱子入口處。更換或清洗接口但柱壓升高很多

峰形變寬，柱壓升高柱頭處的填料柱床發(fā)生塌陷。柱子已經(jīng)劣化了，更換柱子柱壓正常，但峰形發(fā)生變化柱頭處由于發(fā)生吸附作用填料被污染根據(jù)操作說明清洗柱子（有時是接口處吸附并累計(jì)不溶物所造成的）

峰開叉柱中填料間出現(xiàn)縫隙（形成多流路）柱子已經(jīng)劣化了，更換柱子保護(hù)柱問題回答我在使用

TSKgelG3000SWXL色譜柱時，發(fā)現(xiàn)柱頭處的柱床有空隙.。

我該怎樣修復(fù)？參考操作說明使用

Top-offgel來充填。空隙不大時可以通過這個方法來解決。使用

TSK-GEL

SW(XL）色譜柱來分離水溶性蛋白質(zhì)時

的典型流動相是什么？

含有0.3MNaCl的50mM的磷酸緩沖液(pH6.8)。使用TSKgelG3000SWXL來分離膜蛋白時，可以使用

什么條件？

通常，可以使用含有0.2mol/L

NaCl的50mmol/L的磷酸緩沖液

（pH7.0），20%丙三醇

和去垢劑

（e.g.0.2%TritonX-100)。

圖譜會因?yàn)槭褂萌ス竸┑姆N類和濃度不同而發(fā)生變化。

參考我們的SeparationReportNo.50。我在使用

TSKgelG3000SWXL時，流動相中加入了去垢劑。我是否需要換成不含去垢劑的流動相？

只有在專用色譜柱時才推薦流動相中有去垢劑。去垢劑很難被徹底除去，

即使清洗色譜柱。使用

TSKgelG3000SWXL時能否使用含有g(shù)uanidine-HCl或尿素之類變性劑的流動相？可以使用含有

6Mguanidine-HCl或

8Murea的流動相。但是，在使用前需要先過濾除去流動相中的不溶物，或安裝過濾頭。

由于變性劑會使流動相的粘度升高，從而使柱壓升高，因此分離分析時的流速需要控制地低一些。此色譜柱需要用作使用變性劑的專用柱。TSKgelG-Oligo-PW一般用于分離什么樣品?中性低聚糖或者非離子型的合成低聚物。對于離子型低聚物和水溶性聚合物，可以使用TSKgelG6000PWXL,G5000PWXL,G4000PWXL,G3000PWXL或G2500PWXL色譜柱。FAQ:分子尺寸排阻色譜

(生物分子)問題回答我想用DMF作為流動相來進(jìn)行SEC分析，應(yīng)該使用哪種聚合物標(biāo)準(zhǔn)品，聚乙烯還是聚苯乙烯？疏水