chapter4酶的提取與分離純化

酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化：

是指把酶從組織、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外液中提取出來并使之達(dá)到與使用目的相適應(yīng)的純度。制作：何正波本章學(xué)習(xí)目標(biāo)和要求掌握：

細(xì)胞破碎方法;酶的提取操作;離心方法的分類;膜分離技術(shù);鹽析沉淀分離法;離子交換層析原理、操作;離子交換層析柱劃分依據(jù);凝膠層析原理及分類;電泳分離原理、影響因素.熟悉：

親和層析原理;凝膠電泳、等電聚焦電泳原理及分類.

了解：各分離方法的類別;酶的結(jié)晶方法分類;酶的濃縮與干燥方法.

根據(jù)酶本身的特性，在分離純化工作中必須注意下列問題:（1）分離純化用的原料來源要方便，成本要低；

目的蛋白質(zhì)的含量、活性相對要高；可溶性和穩(wěn)定性要好；

基因分子學(xué)的背景知識要有深入的了解；如果是重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)水平及表達(dá)方式均要確定。（2）防止酶的變性失活

破碎細(xì)胞的條件要盡可能地溫和；

盡早盡可能多地去除各種雜質(zhì)、脂類、核酸及毒素；使用極性條件要以目的蛋白質(zhì)的活性和功能不受損害為原則；

低溫和潔凈的環(huán)境必不可少；要避免和防止過酸、過堿、重金屬離子、變性劑、去污劑、高溫、劇烈的機械作用和自身毒素等諸多因素。（3）緩沖溶液

操作緩沖溶液中的物質(zhì)成分要謹(jǐn)慎考慮，避免隨意性;

除去對可溶性及緩沖容量的考慮之外，蛋白水解酶和核酸酶抑制劑、抑制微生物生長的殺菌劑、穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和酶活性的還原劑及金屬離子等均應(yīng)依不同蛋白質(zhì)和酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)予以周全考慮。（4）檢測手段

建立靈敏、精確、特異的檢測手段是評估純化方法、判斷目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率、活性、純度的前提。

酶活性檢測可根據(jù)特異性底物的反應(yīng)；其它目的蛋白質(zhì)的檢測在未能建立特異性的免疫學(xué)檢測方法之前不僅要檢測它總生物活性，還要有相應(yīng)判定指標(biāo)，保證檢測的特異性.（5）純化策略的選擇應(yīng)該選擇不同機制的分離單元（方法）組成一套工藝；

應(yīng)將含量多的雜質(zhì)先分離去除；應(yīng)盡早采用高效分離手段；

將最昂貴、最費時的分離方法放在最后階段。也就是說，通常先運用非特異、低分辨率的操作方法，如沉淀、超濾和吸附層析等，這一階段的主要目的是盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)；隨后是高分辨率的操作方法，如具有高選擇性的離子交換色譜和親和層析，而將凝膠過濾層析這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，這樣可使分離效率提高。Contentsofchapter41、酶的提取與分離純化技術(shù)路線2、酶溶液的制備3、酶的提取8、酶的制劑與保存7、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶GoGoGoGoGo6、酶的分離方法Go4、酶溶液的絮凝、凈化與脫色Go5、酶溶液的濃縮Go第一節(jié)酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。生物材料AB純化階段分析方法酶提取蛋白粗分級AmmoniumsulfateOrganicsolvent層析粗蛋白GelfiltrationIonexchangeAffinitychromatographyFPLC電泳PreparativeelectrophoresisIsoelectricfocusing部分純化純酶均質(zhì)酶Protein/ActivityassayElectrophoresis:NativePAGESDSGradientPAGEKineticanalysisMolecularweightSedimentationcoefficientdeterminationQuaternarystructureIsoelectricfocusingPeptidemappingAminoacidanalysisAminoacidsequencingExtinctioncoefficient抗體Immunoassays:ImmunoblottingELISADoublediffusionImmunoelectrophoresis結(jié)晶X-raycrystallographySpectroscopicmethods:CDORDNMR&ESR生物材料的背景知識第二節(jié)酶溶液的制備

把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液。

酶溶液的制備包括：

材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎、抽提、凈化脫色、抽提液的濃縮等幾個步驟。一.材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎1.材料預(yù)處理

酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：胞外酶，胞內(nèi)酶（游離酶和膜結(jié)合酶）。微生物胞外酶可以用鹽析或有機溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥；胞內(nèi)酶要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取；動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等；植物材料應(yīng)避免單寧等物質(zhì)著色污染。

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細(xì)胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同。2.細(xì)胞破碎1、機械破碎法2、物理破碎法3、化學(xué)破碎法4、酶促破碎法機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理1）搗碎法

利用搗碎機高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。一般用于動物組織，植物肉質(zhì)種子，柔嫩的葉，芽等材料的破碎。

2）研磨法

利用研缽、石磨、細(xì)菌磨、球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎.

助磨劑：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化鋁工業(yè)：高速珠磨機（High-speedbeadmill）如：Dyno-mill球磨機3）勻漿法（homogenization）

利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。勻漿器的研杵的磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙常保持在十分之幾毫米距離。破碎細(xì)胞的程度比組織搗碎機高。大型細(xì)胞破碎器：

Manton-Gaulin勻漿器主要是高壓下使細(xì)胞通過小孔隙而被擠碎，每小時可處理數(shù)十升至數(shù)千升樣品，適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。對于酵母等難破碎及高濃度細(xì)胞可采用多次循環(huán)方法絲狀真菌、較小的G+菌不宜用此法1）壓力差破碎法

通過壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。高壓沖擊法、突然降壓法（如：爆破性減壓法）

、滲透壓變化法2）溫度差破碎法

利用溫度的突然變化，由于熱脹冷縮的作用而使細(xì)胞破碎的方法稱為溫度差破碎法。

反復(fù)凍融多次,由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎.

3）超聲波破碎法（Ultrasonication）

利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用而使細(xì)胞破碎的方法稱為超聲波破碎法.特別適用于微生物細(xì)胞的破碎.

桿菌比球菌容易破碎

G-比G+容易破碎酵母菌不易破碎超聲波細(xì)胞粉碎機高壓細(xì)胞破碎機1）有機溶劑有機溶劑可以便細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，便胞內(nèi)酶等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到細(xì)胞外.應(yīng)低溫操作,以防止酶變性失活.如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等.2）表面活性劑：表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而增加細(xì)胞膜的透過性.

一般采用非離子型的表面活性劑.如Triton,Tween等.化學(xué)破碎法

將細(xì)胞在一定的PH值和溫度條件下保溫一段時間利用細(xì)胞本身酶系的作用，使細(xì)胞破壞，而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法，稱為自溶法。

G+細(xì)菌肽多糖溶菌酶酵母β-葡聚糖

β-葡聚糖酶霉菌幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)酶纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶混合使用對植物細(xì)胞具有良好的破碎效果.價格高，通用性差，產(chǎn)物抑制的存在酶促破碎法（Enzymaticlysis）（一）酶提取的方法（二）影響酶提取的主要因素二、酶的提取

大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽，稀堿或稀酸的水溶液進行抽提；抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。

鹽溶現(xiàn)象/鹽析現(xiàn)象

用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶.一般采用稀鹽溶液進行酶的提取，濃度一般控制在0.02~0.5mol/L。常采用等滲溶液，即0.125mol/LNaCl和0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸緩沖液或0.1mol/LTris-HCl。必要時，緩沖液中可加入EDTA（1~5mmol/L）、巰基乙醇（3~20mmol/L）等。例：

酵母醇脫氫酶用0.5mol/LNa2HPO4溶液提取。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取?？莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。1、鹽溶液提取例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取pH值與酶的穩(wěn)定性相關(guān)，選擇pH不能超出酶的穩(wěn)定范圍，從抽提效果而言pH值要偏離目的酶等電點，也就是說酶如果是酸性蛋白質(zhì)則宜用稀堿溶液來抽提，反之堿性蛋白用酸來抽提。2、酸溶液提取例：細(xì)菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的堿溶液提取。3、堿溶液提取

一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶難溶于水,稀鹽,稀酸,或稀堿中,常用不同比例的有機溶劑提取。

如植物種子中的酶，一般用70%~80%的乙醇來提取。動物細(xì)胞微粒體中的酶用正丁醇來提取。

常用的有機溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等,這些溶劑可以與水互溶或部分互溶,同時具有親水性和親脂性。

例：琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶等，用丁醇提取，都取得良好效果。4、有機溶劑提取1、溫度

為防止變性失活,制備具有活性的酶,提取溫度一般不易過高，一般在0℃~10℃的低溫操作.

但如果抽提的酶比較穩(wěn)定也可以用高溫。如胃蛋白酶可以在37℃抽提。

酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān).

首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)遠(yuǎn)離等電點；一般選擇pH4-6為宜。提取溶劑的pH應(yīng)在酶的穩(wěn)定范圍內(nèi),為了提高酶的溶解度，提取時pH值應(yīng)避開酶的等電點。2、pH值

在提取操作時適當(dāng)加入底物或輔酶成分，可以改變提高酶的穩(wěn)定性。為了防止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺酰氟）；為防止氧化，則加入半胱氨酸或巰基乙醇。3、提取液的體積

一般為原料體積的3-5倍，最好分幾次提取。4、輔助因子

含酶原料顆粒大小、攪拌、提取時間。攪拌能促使被提取物的溶解,一般采用溫和攪拌為宜,速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫,增大了與空氣的接觸面,會引起酶等物質(zhì)的變性失活.5、其他三、酶溶液的絮凝、

凈化與脫色

由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困難；因此要用絮凝劑進行處理。（一）絮凝

絮凝劑有無機（如醋酸鈣,磷酸鈣,硫酸鋁,氯化鋁,硫酸鐵,氯化鐵等），有機（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如殼多糖等）等多種類型。絮凝:

將溶液中不需要的成分通過絮狀凝集的方式去除的過程.在此過程中用到的助劑稱為絮凝劑（二）過濾或離心凈化

通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細(xì)胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。1、離心分離——從細(xì)胞抽提物中除掉固體離心機的選擇：工業(yè)：連續(xù)流動離心機、間歇卸料的圓盤式離心機2、過濾——從細(xì)胞抽提物中除掉固體渦流膜過濾法（cross-flowmembranefiltration）（三）脫色

酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1.5%。四、酶溶液的濃縮冷凍干燥法：先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。蒸發(fā)法：目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達(dá)到濃縮的目的。超過濾法：

將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。膠過濾法：

利用SephadexG-250或G-50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。其它方法：

吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。干燥：

將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過程。方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥。第三節(jié)酶分離純化的方法一、酶分離純化方法的選擇

目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的。在選擇分離純化方法時，要考慮以下幾個方面：首先對待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)；嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。遵循原則：1、根據(jù)使用目的(工業(yè)用、分析用、醫(yī)用）—質(zhì)量要求；2、制備方法的經(jīng)濟性（符合步驟短、收率高、成本低的要求）；3、按蛋白質(zhì)特性，操作要求：低溫、pH(4-10)、表面變性、重金屬、有機溶劑、水質(zhì)、輔因子、蛋白酶等；4、根據(jù)酶的特點可采用：選擇性變性、親和性、酶活性測定等特殊手段。1、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法2、根據(jù)溶解度建立的分離方法3、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計的分離方法4、根據(jù)親和作用建立的純化方法GoGoGoGo一、酶分離純化方法的選擇（一）根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

這類方法包括透析，超過濾，離心以及凝膠過濾等。

1、透析(Dialysis)法：原理：透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機鹽單糖等分開。透析袋的預(yù)處理：(1)將透析管剪成適當(dāng)長度(10-20cm)的小段，即形成透析袋。(2)在大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10min。(3)將透析袋用蒸餾水徹底漂洗。(4)將透析袋置1mMEDTA(pH8.0)中煮沸10min。(5)待透析袋冷卻，存放于4℃，應(yīng)確保透析袋始終浸沒在液體中。

注：從此步起用透析袋時一定要戴手套操作。(6)在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。透析（dialysis）常用的透析袋類型：

再生纖維素膜透析袋纖維素酯透析袋。有多種型號和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（1102Da）；商品名為spectrapor等。過程：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中；2.過濾類別截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金愿等微濾0.2~2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?~0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜原理：

利用壓力、抽濾或離心力強行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，強行使水和其它小分子溶質(zhì)通過膜，而所需的酶分子被濾膜截留，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。超過濾(Ultrafiltration)法加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液超過濾（ultrafiltration）為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅(qū)動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。制備超濾膜的材料：多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)：截留分子量、耐受壓力、濾速和有效過濾面積等；主要商品型號有AmiconDiaflo系列等。

超濾器類型：有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。（1）離心機的選擇3、離心分離1）常速離心機又稱低速離心機最大轉(zhuǎn)速：8000r/min相對離心力：＜1×104gRCF=1.12×10-5×r×n2

RCF=相對離心力

r=旋轉(zhuǎn)半徑（厘米）n=每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)主要用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘渣等固形物及粗結(jié)晶等較大的顆粒。2）高速離心機轉(zhuǎn)速：

1×104－2.5×104r/min相對離心力（RCF）：

1×104－10×105g主要用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片、較大的細(xì)胞器等高速冷凍離心機3）超速離心機轉(zhuǎn)速：2.5×104－12×104r/min相對離心力：5×105g主要用途：分離DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化。超速離心機的精密相當(dāng)高。為了防止樣品液溢出，一般附有離心帽；為了防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)。此外還有一系列安全保護系統(tǒng)、制動系統(tǒng)及指示儀表等。原理：采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在大離心力的條件下進行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”，如此，多次離心處理，即能把液體中的不同沉降速度的顆粒分批分離出來。常用于分離大小和密度相差較大的顆粒。1）差速離心法（2）離心方法的選用2）密度梯度離心

（densitygradientcentrifugal）原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。

每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。梯度介質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)具有足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍；不與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)；不會引起樣品中組分的凝集、變性或失活。常用介質(zhì)：蔗糖、甘油蔗糖：濃度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm24、凝膠過濾法原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴展，大于凝膠孔徑的分子不能進入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。層析(色譜）分子篩—

凝膠過濾法葡聚糖凝膠

SephadexG:

有SephadexG-10~G-200共8種型號；G后面的數(shù)字是表示不同的交聯(lián)度，數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，吸水量越大，其數(shù)值越為吸水量的10倍；pH穩(wěn)定范圍為2-11；分子量分級范圍為~8105；親水性強。凝膠的類型與選擇：Sephadex

葡聚糖凝膠Sephacryl凝膠葡聚糖凝膠：

商品名Sephadex或Bio-gelA，它是由鏈狀葡聚糖通過交聯(lián)劑聚合而成；聚丙烯酰胺凝膠Bio-GelP：有Bio-GelP2~Bio-GelP300共10個型號；P后面的數(shù)字乘以1000表示其分離的最大分子量（排阻分子量）；過酸或過堿時不穩(wěn)定；在pH5.5-6.5時可以高壓滅菌；在大多數(shù)緩沖液中都可使用；pH穩(wěn)定范圍為2-10；分級范圍為1102~6104。

瓊脂糖凝膠:

有Sepharose；是從海藻中提取出來的多糖混和物;凝膠的孔徑大小是通過瓊脂糖濃度來控制的；分級范圍很寬；但對溫度要求嚴(yán)格（2-30℃），40℃以上時易融化，低于0℃時易堵塞。凝膠過濾法Flash(一)沉淀分離

沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，從溶液中沉淀析出與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。二、根據(jù)溶解度建立的分離方法1、鹽析(SaltingOut)法

最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時）。加入飽和硫酸銨：100ml溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)V=V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表”。⑴基本原理

有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)(酶),核酸,多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用,是較早使用的沉淀方法之一.

其原理主要是:

①降低水溶液的介電常數(shù),導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀.（F=Q1Q2/εr2

）

②由于使用的有機溶劑與水互溶,它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子,破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜,因而發(fā)生沉淀作用.2、有機溶劑沉淀法常用：乙醇,甲醇和丙酮.①分辨能力比鹽析法高,即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀.

②沉淀不用脫鹽,過濾比較容易(如有必要,可用透析袋脫有機溶劑).因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用.有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是:有機溶劑沉淀法的缺點：

對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活,操作需在低溫下進行.1)溫度:

酶在有機溶劑中對溫度特別敏感,溫度稍高就會引起變性,且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng),因此有機溶劑必須預(yù)冷,操作要在冰鹽浴中進行.一般都要在低溫下進行（0℃±1℃）2)樣品濃度:

低濃度樣品回收率低,要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀.高濃度樣品,可以節(jié)省有機溶劑,減少變性的危險,但雜蛋白的共沉淀作用大.

選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度才能達(dá)到較好的分離效果。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜.有機溶劑沉淀的影響因素3)pH值:

選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi),通常是選在等電點附近,從而提高此沉淀法的分辨能力.

4)離子強度:

通常鹽濃度以不超過5%為宜,使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的2倍體積為宜,

中性鹽的加入能增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，并能防止蛋白質(zhì)變性，一般采用0.05mol/L以下的稀鹽溶液。沉淀所得的固體樣品,如果不是立即溶解進行下一步的分離,則應(yīng)盡可能抽干沉淀,減少其中有機溶劑的含量,如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑,以免影響樣品的生物活性.3、等電點沉淀法

利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性,通過調(diào)節(jié)溶液的值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而實現(xiàn)酶與雜質(zhì)分離的方法.

可以利用此法進行初步的沉淀分離.

由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近,而且?guī)в兴さ拿傅壬锎蠓肿尤杂幸欢ǖ娜芙舛?不能完全沉淀析出,因此,單獨使用此法分辨率較低,因而此法常與鹽析法,有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用,以提高沉淀能力和分離效果.

此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白,而不用于沉淀目的物.

4、復(fù)合沉淀法

在酶液中加入某些物質(zhì)，使其與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為復(fù)合沉淀法.

常用的復(fù)合沉淀劑有：聚乙二醇、聚丙烯酸、單寧.

如聚丙烯酸（PAA）可以與某些堿性酶蛋白，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過程如下：

PAA+酶PAA-酶

PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO42-CaSO4+PAA5、選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使爵液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的畸，從而使酶與雜質(zhì)分離

熱變性、有機溶劑變性和pH變性

α-淀粉酶——熱變性紅細(xì)胞酶——乙醇-氯仿(二)萃取分離

萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其他流體。有機溶劑萃取雙水相萃取超臨界萃取反膠束萃取

有機溶劑萃取的兩相分別為水相和有機溶劑相，利用溶質(zhì)在水和有機溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離。乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如:用丁醇萃取微粒體或線粒體中的酶；用苯酚萃取RNA等。

注意事項:(1)低溫操作;(2)盡量縮短酶與有機溶劑接觸的時間.1.有機溶劑萃取2.雙水相萃取適用于直接從含有菌體等雜質(zhì)的酶液中提取純化目的酶。原理：利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。開始于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)已應(yīng)用到酶、核酸、生長激素、病毒等分離提純。技術(shù)誕生

1896年Beijerinck觀察到明膠-瓊脂水溶液混合、明膠-淀粉水溶液混合先得到一渾濁不透明溶液，隨后分為兩相。1）兩相的組成

2）高分子聚合物的分子量、濃度、極性等

3）兩相溶液的比例

4）酶的分子量、電荷、極性等

5）溫度、pH值等影響酶在兩相中分配系數(shù)的因素雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點雙水相體系為酶的溶解和抽提提供了適宜環(huán)境，而且處理容量大。設(shè)備簡單。操作方便、快速、條件溫和。不需處理就可與后續(xù)提純步驟相銜接。幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例

酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶BrevibacteriumspPEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶BacillussphaericusPEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽3.超臨界萃取

超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。

超臨界流體4.反膠束萃取

反膠束萃取是利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。反膠束，又稱為反膠團，是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體。三、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計的分離方法吸附法（吸附交換分離法）電泳法離子交換色譜

根據(jù)吸附機制的不同可分為3種：物理吸附法，羥基磷灰石法和離子交換吸附法。是利用樣品中不同分子與吸附劑之間的吸附和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離的目的；操作方式有靜態(tài)吸附和柱層析兩種方式。操作過程包括：吸附劑的平衡與活化，加樣吸附，洗滌和洗脫。（一）吸附法（吸附交換分離法）

常用的吸附劑有硅藻土，活性氧化鋁，淀粉和活性炭等。預(yù)先洗滌和活化后，在低鹽，弱酸或近中性條件下加樣吸附，再在弱堿條件下進行洗脫。常采用靜態(tài)方式進行。1、物理吸附法：

羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團發(fā)生相互作用；也是在低鹽和弱酸或中性條件下進行吸附；洗脫時提高離子強度；多采用柱層析方式進行。2、羥基磷灰石法

利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。離子交換劑：一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團（離子交換基）兩部分組成。根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)可以將離子交換劑分為3種類型：離子交換樹脂，離子交換纖維素和離子交換球型多糖(如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等)。3、離子交換吸附法（離子交換色譜法）離子交換樹脂

是一種特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物，其母體原料是一些不溶性的交聯(lián)聚苯乙烯等，活性基團通過化學(xué)反應(yīng)連在母體上。離子交換纖維素

是目前酶分離純化中應(yīng)用最廣泛的一種離子交換劑；是在纖維素母體上引入功能基團組成的。離子交換球型多糖

以交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖為母體，引入功能基團而成的。強酸型(硝酸基)陽離子交換劑弱酸型(羧基)陽離子交換劑強堿型(季胺鹽)陰離子交換劑弱堿型(伯胺基)陰離子交換劑等。

根據(jù)離子交換基所帶電荷性質(zhì)和解離狀況可以分為：離子交換劑類型的選擇,應(yīng)考慮以下幾個因素：參考電泳結(jié)果：在中性或偏堿性條件下進行電泳，向陽極移動較快的酶，可選用陰離子交換劑；向陰極移動較快的酶可被陽離子交換劑吸附。待分離酶的穩(wěn)定性：待分離酶如果在低于pI的條件下穩(wěn)定，則選用陽離子交換劑；待分離酶如果在高于pI的條件下穩(wěn)定，則選用陰離子交換劑。待分離酶的pI：pI<6時選用強堿型陰離子交換劑；pI>9時選用強酸型陽離子交換劑；pI在6-9之間選用強型弱型均可。

離子交換層析的操作過程：包括離子交換劑的預(yù)處理及平衡，裝柱，加樣吸附，洗脫，洗脫液收集及檢測，離子交換劑的再生。（二）電泳法

在直流電場中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。

帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。膜電泳：以濾紙、聚酰胺薄膜，醋酸纖維薄膜等為支持物的一類電泳分離方法。粉末電泳：以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法。凝膠電泳：以聚丙烯酰胺為支持物，兼有分子篩效應(yīng)。1、區(qū)帶電泳：是在惰性支持物上進行電泳時樣品中各組分遷移速度不同而分布成區(qū)帶的一類電泳分離方法。按支持物的物理性狀可分為3種類型：上：凝膠電泳左：紙電泳凝膠電泳測分子量2、等點聚焦電泳

當(dāng)?shù)入婞c不同的蛋白質(zhì)分子處于一個由陽極到陰極pH值梯度逐漸增加的介質(zhì)中,并通以直流電,“聚焦”在與其等電點相同的pH值位置上，形成位置各異的不同區(qū)帶，這種電泳方法稱為等點聚焦電泳。這種方法可以區(qū)分等電點只有0.01pH值單位差異的蛋白質(zhì)。

電泳中pH值梯度的形成取決于兩性蛋白質(zhì)載體。在電泳系統(tǒng)中加入不同等電點的兩性電解質(zhì)載體，通入直流電后，即在電場作用下形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。目前主要采用的商品載體兩性電解質(zhì)是Ampholine,它是一系列不同等電點的脂肪族多氨基多羧基同系物及異構(gòu)物的混合物3、高效毛細(xì)管電泳4、聚焦層析垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳圓盤電泳

(三)離子交換色譜

離子交換層析是利用在離子交換劑上的可解離基團(活性基團)對各種物質(zhì)的吸附力不同而使不同物質(zhì)分離的方法。離子交換劑分為兩部分：一部分是不能移動的多價的高分子基團，構(gòu)成骨架；另一部分是活性離子，它在樹脂中進出發(fā)生離子交換。活性離子是陽離子，能吸附陰離子的稱為陽離子交換樹脂；相反則稱為陰離子交換樹脂。離子交換法離子交換Flash四、根據(jù)親和作用建立的純化方法

由于酶對底物，競爭性抑制劑,輔酶等配體具有較高的親和力，而其它雜蛋白對這些配體則沒有或有很弱的親和作用，因此，可以根據(jù)酶與雜蛋白對配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。目前已經(jīng)建立的方法有親和層析法和親和電泳法等。1、親和層析法：

親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.親和層析的四個要素載體配體臂待分離組分親和吸附洗滌洗脫再生雜蛋白目的酶圖.