土壤中分解尿素、纖維素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)一、課題背景1.尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32.常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。[該去哪里取樣?][該配置怎樣的培養(yǎng)基?]2、方法：⑴造成有利于目的菌株生長的環(huán)境⑵同時抑制大多數(shù)其他類型微生物閱讀P21

篩選菌株1、土壤中取樣。怎樣分離能分解尿素的細(xì)菌？15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素③此配方培養(yǎng)基為什么能夠篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌?氮源是尿素，只允許能以尿素作為氮源的微生物生長。1.利用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基分離出的微生物①只是一種細(xì)菌嗎？②都是能分解尿素的微生物嗎？2.請你提供一種方法，判斷分解尿素的細(xì)菌確實能將尿素分解成氨。4.怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑（P26）以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長尿素細(xì)菌生長多種微生物（菌落數(shù)明顯多于實驗組）是如何統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌？計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法稀釋涂布平板法比濁法膜過濾法1.顯微鏡直接計數(shù)法：這種方法是利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B稀釋涂布平板注意事項①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的培養(yǎng)皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。關(guān)鍵：恰當(dāng)?shù)南♂尪热绻?06稀釋度下的三個重復(fù)組菌落數(shù)分別為1個、50個、170個。應(yīng)如何處理這個稀釋組的數(shù)據(jù)？◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。106第一天結(jié)束時1號培養(yǎng)皿372號培養(yǎng)皿403號培養(yǎng)皿32在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。此記錄是否完整？P22統(tǒng)計菌落數(shù)A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))如何證明A同學(xué)制作的培養(yǎng)基確實被污染了？如何證明A同學(xué)操作有問題？方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。實驗設(shè)計[一]土壤取樣◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封滅菌。①準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管。

②稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。[二]制備培養(yǎng)基

◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度（三）樣品的稀釋（四）取樣涂布（五）微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。某細(xì)菌固體培養(yǎng)基的組成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、瓊脂和蒸餾水，其中凝固劑是＿＿＿＿＿＿＿，碳源是＿＿＿＿＿＿＿，氮源是＿＿＿＿＿＿＿。已知只有能合成脲酶的細(xì)菌才能在該培養(yǎng)基上生長，故該培養(yǎng)基屬于＿＿＿＿培養(yǎng)基。從同化作用類型上看，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌屬于＿＿＿＿。瓊脂

葡萄糖尿素選擇異養(yǎng)型在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是

A．調(diào)整期B．對數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期答案：C1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（）A.在液體培養(yǎng)基上進行B.至少接種一種細(xì)菌C.接種一個細(xì)菌D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）A.培養(yǎng)細(xì)菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素A

CD4.下列說法不正確的是（）A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。B5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽C常見選擇培養(yǎng)的方法1、在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)（1）青霉素分離酵母菌和霉菌(2)高濃度食鹽金黃色葡萄球菌2、改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（1）缺乏氮源固氮微生物（2）含無機碳源自養(yǎng)微生物(3)石油作為唯一碳源能消除石油污染的微生物3、改變微生物的培養(yǎng)條件（1）高溫耐高溫微生物（2）無氧厭氧型、兼性厭氧型課題3分解纖維素的微生物的分離

是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。1.纖維素與纖維素酶纖維素是地球上含量最豐富的

。多糖類物質(zhì)棉花一基礎(chǔ)知識纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶2.纖維素分解菌的篩選①篩選纖維素分解菌的方法是_____________。該方法可以通過_______反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色②其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被__________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以____________為中心的_________，我們可以通過______________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈剛果紅能與哪項物質(zhì)形成紅色復(fù)合物A．纖維二糖B．纖維素

C．葡萄糖D．麥芽糖1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落本實驗流程與尿素分解菌的分離實驗流程有哪些異同？選擇培養(yǎng)1.選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物2.制備選擇培養(yǎng)基參照課本29頁旁欄a.旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b.這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？c.你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照選擇培養(yǎng)時應(yīng)將錐形瓶固定在A．桌子上B．溫箱里

C．窗臺上D．搖床二、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)到106參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落使用剛果紅染色法時，加入剛果紅的時機是：①制備培養(yǎng)基時

②梯度稀釋時

③倒平板時

④涂布時

⑤培養(yǎng)基上長出菌落時

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤C練一練1.在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學(xué)觀點？A.生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點B.生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點C.生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點D.生物發(fā)展進化的觀點C2.從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是①土壤取樣②梯度稀釋③選擇培養(yǎng)④菌懸液涂布平板⑤挑選出單個菌落A.①②③④⑤B.①③②④⑤C.①②④③⑤D.①④②③⑤B3.有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是A.可以增加纖維素分解菌的濃度B.可以減少纖維素分解菌的濃度C.所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基D.所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基A【練一練】

有些微生物能合成纖維素酶，通過對這些微生物的研究和作用，使人們能夠利用秸稈等廢棄物生產(chǎn)酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。研究人員用化合物A、硝酸鹽、磷酸鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功的篩選到能產(chǎn)生纖維素酶的微生物。分析回答問題。

(1)培養(yǎng)基中加入的化合物A是________，為微生物的生長提供________，這種培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。

(2)為了篩選出能產(chǎn)生纖維素酶的微生物，向培養(yǎng)基中加入________。纖維素碳源選擇