核酸研究方法

制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定第1頁/共39頁真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化第2頁/共39頁制備RNA時(shí)，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離第3頁/共39頁（三）核酸含量的測定第4頁/共39頁2、定糖法

RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）

DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個(gè)A～50μg/ml

雙鏈DNA

～40μg/mlRNA或單鏈DNA第5頁/共39頁3、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當(dāng)于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復(fù)合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比第6頁/共39頁純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280第7頁/共39頁二、核酸的沉降特性與超速離心

不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來第8頁/共39頁8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時(shí)：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測定第9頁/共39頁G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

（二）測定DNA的G-C含量第10頁/共39頁RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構(gòu)象第11頁/共39頁（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或第12頁/共39頁用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳第13頁/共39頁第14頁/共39頁用于小片段DNA的分析相對分子質(zhì)量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時(shí)不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第15頁/共39頁（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定第16頁/共39頁英國Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958獲諾貝爾化學(xué)獎1975設(shè)計(jì)出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學(xué)獎合成一段與待測DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。

第17頁/共39頁第18頁/共39頁末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。第19頁/共39頁第20頁/共39頁第21頁/共39頁MOV:MCB4.0\DideoxysequencingofDNA第22頁/共39頁DNA序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP第23頁/共39頁（二）DNA的化學(xué)法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應(yīng)，可使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

第24頁/共39頁4組特異的反應(yīng)如下：（1）G反應(yīng)：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應(yīng)：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應(yīng)：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應(yīng)：當(dāng)有鹽存在時(shí)，只有C與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂第25頁/共39頁

32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和

32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG第26頁/共39頁硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG

肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P*ACTTCGACAG第27頁/共39頁（三）RNA的測序

RNA的測序方法有3個(gè)：（1）用酶特異切斷RNA鏈：（2）用化學(xué)試劑裂解RNA（3）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第28頁/共39頁1995年K.Mullis發(fā)明?；静襟E為：1.設(shè)計(jì)一對引物以便有效擴(kuò)增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.優(yōu)化反應(yīng)體系：包括適量模板、引物、4種dNTP、TaqDNA聚合酶和適量Mg2+五、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第29頁/共39頁3.選擇3個(gè)溫度進(jìn)行熱循環(huán)：變性94℃，45－60s；退火，根據(jù)引物的Tm，1min；延伸，72℃，1min。循環(huán)4.擴(kuò)增完成后取出一定量的反應(yīng)產(chǎn)物，檢測擴(kuò)增結(jié)果：先進(jìn)行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結(jié)果第30頁/共39頁y=產(chǎn)物；x=擴(kuò)增效率；n＝循環(huán)次數(shù)第31頁/共39頁(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)第32頁/共39頁溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。第33頁/共39頁①模板DNA（單鏈）②引物③DNA聚合酶（Taq）④dNTP⑤Mg2+MOV:MCB4.0\POLYMERASECHAINREACTION第34頁/共39頁六、DNA