第十二章DNA合成

DNARNA生物遺傳信息傳遞的化學(xué)本質(zhì)，在分子水平看就是：復(fù)制本質(zhì)：遺傳信息全部傳遞給子代DNA分子。隨分裂DNA進(jìn)入子細(xì)胞，通過表達(dá)的蛋白質(zhì)控制生長發(fā)育。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯生理功能蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，不同時(shí)期DNA表達(dá)不同蛋白質(zhì)從而控制整個(gè)生命活動(dòng)過程。第十二章核酸的生物合成DNA復(fù)制的化學(xué)本質(zhì)和機(jī)制如何？DNA復(fù)制的化學(xué)本質(zhì)和機(jī)制如何？DNA復(fù)制的化學(xué)本質(zhì)和機(jī)制如何？復(fù)制復(fù)制復(fù)制

DNA的半保留復(fù)制DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制的過程真核生物DNA的復(fù)制本章內(nèi)容中心法則第一節(jié)DNA生物合成的一般規(guī)律一、半保留復(fù)制及證據(jù)二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向三、DNA是半不連續(xù)復(fù)制的第二節(jié)DNA聚合酶一、參與DNA復(fù)制的酶和輔助因子第三節(jié)細(xì)胞DNA復(fù)制的階段一、DNA復(fù)制的起始二、DNA復(fù)制的延長三、DNA合成終止過程二、DNA聚合酶Ⅰ或Ⅲ反應(yīng)中心鏈延長機(jī)制第一節(jié)DNA生物合成的一般規(guī)律DNA復(fù)制：以親代DNA分子為模板指導(dǎo)合成相同的子代DNA分子的過程。親代DNA作模板新合成的子鏈DNA片段DNA復(fù)制半保留復(fù)制：親代DNA雙鏈解開，分別作為模板指導(dǎo)合成互補(bǔ)的DNA鏈，在子代DNA中一條鏈來自于親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?。DNA的這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。一、半保留復(fù)制及證據(jù)實(shí)驗(yàn)1：1958年Meselson和Stahl利用氮的同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復(fù)制。E.coli，15NH4Cl為唯一氮源，培養(yǎng)12代，從而使所有E.coliDNA標(biāo)記上15N。15N-DNA比14N-DNA的密度大。氯化銫密度梯度離心

親代F1

15N

F2

用15N-NH4Cl為唯一碳源連續(xù)培養(yǎng)多代用含14N培養(yǎng)基培養(yǎng)1代后15N/15N重DNA用含14N培養(yǎng)基培養(yǎng)2代后14N/15N雜合DNA14N/14N輕DNA14N/15N雜合DNA密度梯度增加實(shí)驗(yàn)2：1963年Cairns用放射自顯影（autoradiograph）的方法第一次觀察到完整的正在復(fù)制的大腸桿菌染色體DNA.3H-dTTP標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過將近兩代時(shí)間。溶菌酶消化細(xì)胞壁放射自顯影BC二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向研究證明許多DNA復(fù)制是從固定的起點(diǎn)開始，在復(fù)制起點(diǎn)處存在有多個(gè)富含A-T對的回文序列列結(jié)構(gòu)。并有多種蛋白和酶參與DNA復(fù)制的起始過程。復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起始有關(guān)蛋白作用下復(fù)制起點(diǎn)部分雙螺旋雙鏈解開，分別作模板指導(dǎo)新鏈合成。DNA復(fù)制是邊解鏈邊復(fù)制，復(fù)制點(diǎn)呈分叉狀，分叉點(diǎn)稱為復(fù)制叉。解鏈部分稱為復(fù)制眼；復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制叉親代DNA親代DNA復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制叉會(huì)合處復(fù)制終點(diǎn)連續(xù)合成復(fù)制不連續(xù)合成復(fù)制泡的兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向移動(dòng)，雙鏈不斷解開，復(fù)制不斷向兩側(cè)推進(jìn)。新合成的子代鏈與親本鏈互補(bǔ)，并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的子代DNA。三、DNA是半不連續(xù)復(fù)制的3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′復(fù)制叉移動(dòng)方向新鏈合成是從5′→3′端進(jìn)行的其中一條鏈從起始點(diǎn)開始連續(xù)合成，并與復(fù)制叉前進(jìn)方向一致——前導(dǎo)鏈另一條鏈合成方向雖相同，但是不連續(xù)合成的，即先合成岡崎片段，然后再連接成完整的子鏈——滯后鏈（后隨鏈）岡崎片段3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′復(fù)制叉移動(dòng)方向復(fù)制叉移動(dòng)方向?qū)槠螌槠?′5′DNA后隨鏈合成過程：引物RNA5′3′5′3′5′3′引物RNA引物RNA3′5′5′引物RNA5′引物RNA5′引物RNA3′3′3′3′5′3′3′3′5′3′5′5′3′DNA鏈接酶DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ大腸桿菌(E.coli)在含有3H-dTTP的培養(yǎng)液中，定期取樣小心分離并觀察DNA變化情況，結(jié)果如下：2min2minθ形結(jié)構(gòu)額外的放射性環(huán)額外的放射性環(huán)動(dòng)態(tài)的變化情況：1、復(fù)制泡出現(xiàn)；2、復(fù)制泡增大；3、新生鏈定向延長；四、DNA半不連續(xù)合成佐證2minθ形結(jié)構(gòu)2minθ形結(jié)構(gòu)額外的放射性環(huán)動(dòng)態(tài)的變化情況：額外的放射性環(huán)動(dòng)態(tài)的變化情況：1、復(fù)制泡出現(xiàn)；2、復(fù)制泡增大；3、新生鏈定向延長；1、復(fù)制泡出現(xiàn)；2、復(fù)制泡增大；3、新生鏈定向延長；第二節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶：催化反應(yīng)的要點(diǎn)：

(dNMP)n+dNTP→（dNMP)n+1+PPi

以四種dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）為底物，以DNA鏈為模板，按照堿基配對原則，將相應(yīng)dNMP添加到DNA子鏈的3′羥基形成3′磷酸酯鍵，以此方式不斷延長子鏈DNA。聚合反應(yīng)必須有引物存在。一、參與DNA復(fù)制的酶和輔助因子2、大腸桿菌DNA聚合酶：共有三種，為DNA聚合酶I、II、III。特性IIIIII結(jié)構(gòu)單體酶單體酶寡聚蛋白（12個(gè)亞基）M.W（KD）10388聚合作用√√√連續(xù)聚合作用較小小大聚合反應(yīng)速度16～302～5250～10005′→3′外切酶有有有3′→5′外切酶有無無生物功能復(fù)制中去除引物，填補(bǔ)缺口參與損傷修復(fù)可能參與損傷修復(fù)DNA復(fù)制的主要酶AGTCOOOO3′AGTCOOOO5′模板DNATCAGOOOO5′延長中的DNARNA聚合酶活性中心生長點(diǎn)合成原料：dATPdCTPdGTPdTTP進(jìn)入活性位位點(diǎn)dNTP由誰確定？合成原料：dATPdCTPdGTPdTTPCOppp～～TOppp～～3′OH堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)下，由生長點(diǎn)所對應(yīng)的模板堿基確定。TO3′OH二、DNA聚合酶Ⅰ或Ⅲ反應(yīng)中心鏈延長機(jī)制APPP～～PPi5′→3′聚合酶活性AGCTAGCTAGCTAGCT3′模板鏈5′PPPPPPPPPPPPPPPPAGCTAGCTAGCTAGCT3′5′PPPPPPPPPPPPPPPPⅠ型DNA聚合酶用胰蛋白酶溫和處理，可以把5′→3′核酸酶活性除去，剩下的片段（Mr68000）仍保留著DNA多聚酶活性和校對活性，它被稱為大片段或Klenow片段。完整的Ⅰ型DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性能夠切除與模板鏈錯(cuò)配的核苷酸或RNA片段。TCGT5′3′-OHAPPPPP聚合酶催化形成3′磷酸酯鍵使單核苷酸隨即被添加到3′端TCGT5′3′-OHPPPP3′→5′外切酶活性是DNA聚合酶的“校對”作用3H2OCAT5′AGCTAGCTAGCTAGCT3′PPPPPPPPPPPPPPPPTCGT5′3′-OHATCAPPPPPPPPAGCTAGCTAGCTAGCT3′5′PPPPPPPPPPPPPPPPTCGT5′3′-OHAPPPPP核酸酶3′→5′外切酶活性處于交接處DNA聚合酶Ⅰ聚合5′→3′聚合酶活性與5′→3′外切酶活性：AGCTAGCTAGCTAGCT3′5′PPPPPPPPPPPPPPPPTCGT5′3′-OHAPPPPPTAGC5′3′-OHAPPPPPAGCTAGCTAGCTAGCT3′5′PPPPPPPPPPPPPPPP3′-OHTCGT5′APPPPP5′GPPPTPPP+GPAGC3′-OHAPPPP5′TPGPGP5′TP5′TP5′5′3′-OH5′→3′聚合酶活性5′→3′外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的亞基與功能亞基亞基數(shù)Mr(kd)基因亞基功能αεθτγδδ′χψβ2222211114132271071523533151237polC(dnaE)dnaQ(mutD)holEdnaXdnaX*holAholBholC

holDdnaE外切酶活性3′→5′外切酶活性（校正）穩(wěn)定模塊結(jié)合；核心酶二聚體“鉗”安置復(fù)合物(Clamp-loadingcomplex)增加復(fù)制連續(xù)性的DNA“鉗”Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制叉動(dòng)向解螺旋酶DnaBDNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ前導(dǎo)鏈引物酶引物SSB引物滯后鏈引物復(fù)制叉動(dòng)向復(fù)制叉動(dòng)向第三節(jié)細(xì)胞DNA復(fù)制的階段E.ColiDNA的合成分三個(gè)階段：起始、延長、終止。一、DNA復(fù)制的起始E.ColiDNA復(fù)制起始于復(fù)制原點(diǎn)：oriC，oriC是由245bp組成的,其中的堿基組成特點(diǎn)是富含A-T堿基對，雙鏈易于解開；這個(gè)堿基順序在大多數(shù)細(xì)菌中是高度保守的?！鶪ATCTNTTNTTTT交感順序(consensussequence)3個(gè)13bp串聯(lián)重復(fù)順序DnaA蛋白結(jié)合的4個(gè)9bp順序交感順序TTATCCACA→→←←E.ColiDNA復(fù)制原點(diǎn)E.ColiDNA再原點(diǎn)起始復(fù)制所需的蛋白質(zhì)或酶蛋白質(zhì)或酶Mr(kd)亞基數(shù)功能DanA蛋白521識別原點(diǎn)，在特異位點(diǎn)打開DNA雙鏈DnaB蛋白3006（同亞基）DNA解螺旋酶DnaC蛋白291輔助DnaB與原點(diǎn)結(jié)合HU192類組蛋白，DNA結(jié)合蛋白，刺激DNA復(fù)制引物酶（DnaG)601合成RNA引物SSB75.64(同亞基)結(jié)合單鏈DNA，保證單鏈DNA的模板作用RNA聚合酶4545促進(jìn)DnaA蛋白激活TopoⅡ4004解除復(fù)制叉前的超螺旋Dam甲基化酶321甲基化原點(diǎn)的（5′）GATC順序oriC3個(gè)13bp的交感順序4個(gè)9bp交感順序~20DnaA+ATP起始配合物3個(gè)13bp的交感順序約20個(gè)各帶1個(gè)ATP的DnaA結(jié)合于4個(gè)9bp重復(fù)順序，使DNA圍繞著復(fù)合物卷成一圈；HU+ATP受類組蛋白HU的刺激，三個(gè)富含A-T的13bp交感順序變性DnaBSSB+ATP在DnaC的幫助下，DNA解旋酶（DnaB）進(jìn)一步促使DNA解旋，以備引物和DNA的合成約20個(gè)各帶1個(gè)ATP的DnaA結(jié)合于4個(gè)9bp重復(fù)順序，使DNA圍繞著復(fù)合物卷成一圈；約20個(gè)各帶1個(gè)ATP的DnaA結(jié)合于4個(gè)9bp重復(fù)順序，使DNA圍繞著復(fù)合物卷成一圈；受類組蛋白HU的刺激，三個(gè)富含A-T的13bp交感順序變性受類組蛋白HU的刺激，三個(gè)富含A-T的13bp交感順序變性在DnaC的幫助下，DNA解旋酶（DnaB）進(jìn)一步促使DNA解旋，以備引物和DNA的合成在DnaC的幫助下，DNA解旋酶（DnaB）進(jìn)一步促使DNA解旋，以備引物和DNA的合成DNA復(fù)制起始必須精確受到調(diào)控，因?yàn)槊總€(gè)生命周期復(fù)制只發(fā)生一次?，F(xiàn)已知，復(fù)制起始的時(shí)序受到DNA甲基化和細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜相互作用的影響。E.Coli的oriCDNA是由Dam甲基化酶甲基化的，而甲基化發(fā)生在回文順序（5′）GATC的腺嘌呤N6(m6A)，大腸桿菌的oriC區(qū)密布GATC順序（在245bp的DNA鏈中含有11個(gè)GATC）而在整個(gè)E.ColiDNA256bp中只可能出現(xiàn)一個(gè)Gm6ATC。復(fù)制之后，DNA是半甲基化的，即oriC區(qū)的母鏈?zhǔn)羌谆模潞铣傻逆湜]有甲基化。在下次結(jié)合DnaA蛋白復(fù)制起始前該區(qū)的該位點(diǎn)必須被Dam甲基化酶重新甲基化。二、DNA復(fù)制的延長3′5′5′3′3′5′復(fù)制叉移動(dòng)方向前導(dǎo)鏈解旋酶DnaBⅡ型拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶引物RNA岡崎片段SSB3′5′5′3′3′5′3′5′5′3′3′5′DNA解旋酶解開DNA母鏈，DNA拓?fù)涿附獬山庑冈斐傻耐負(fù)鋸埩?，SSB蛋白穩(wěn)定解開的DNA單鏈。無論前導(dǎo)鏈還是后隨鏈均是在DNA聚合酶Ⅲ催化下合成的。Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制叉動(dòng)向解螺旋酶DnaBDNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ前導(dǎo)鏈引物酶引物SSB引物滯后鏈岡崎片段引物復(fù)制叉上的兩個(gè)復(fù)制事件由一個(gè)DNA聚合酶Ⅲ的二聚體來協(xié)調(diào)完成。這個(gè)二聚體和DnaB解旋酶形成一個(gè)整體復(fù)合物復(fù)制叉上的兩個(gè)復(fù)制事件由一個(gè)DNA聚合酶Ⅲ的二聚體來協(xié)調(diào)完成。這個(gè)二聚體和DnaB解旋酶形成一個(gè)整體復(fù)合物復(fù)制叉上的兩個(gè)復(fù)制事件由一個(gè)DNA聚合酶Ⅲ的二聚體來協(xié)調(diào)完成。這個(gè)二聚體和DnaB解旋酶形成一個(gè)整體復(fù)合物復(fù)制叉動(dòng)向復(fù)制叉動(dòng)向DNA鏈接酶—能將結(jié)合在模板DNA鏈上的岡崎片段連接到一起。DNA鏈接酶NH3+DNA鏈接酶NHPOO－O核糖－AATP或NAD+PPi或NMN+POO－OO－OH3′5′5′3′POOOO－OHPOOO－－核糖－A3′5′5′3′－P－OO－OO3′5′5′3′酶—ATP酶—AMPPOOO－－核糖－AO－DNA鏈接酶三、DNA合成終止過程復(fù)制原點(diǎn)逆時(shí)針復(fù)制叉順時(shí)針復(fù)制叉TerCTerBTerFTerG順時(shí)針復(fù)制叉“陷阱”TerATerDTerB逆時(shí)針復(fù)制叉“陷阱”DNA拓?fù)涿涪騎er是復(fù)制終止位點(diǎn)該順序長約20bp，能被Tus蛋白識別結(jié)合；Tus-Ter僅能從一個(gè)方向逮住復(fù)制叉，每個(gè)復(fù)制期只有一個(gè)Tus-Ter起作用。Ter是復(fù)制終止位點(diǎn)該順序長約20bp，能被Tus蛋白識別結(jié)合；Tus-Ter僅能從一個(gè)方向逮住復(fù)制叉，每個(gè)復(fù)制期只有一個(gè)Tus-Ter起作用。Ter是復(fù)制終止位點(diǎn)該順序長約20bp，能被Tus蛋白識別結(jié)合；Tus-Ter僅能從一個(gè)方向逮住復(fù)制叉，每個(gè)復(fù)制期只有一個(gè)Tus-Ter起作用。復(fù)制原點(diǎn)逆時(shí)針復(fù)制叉順時(shí)針復(fù)制叉TerC順時(shí)針復(fù)制叉“陷阱”TerATerFTerG逆時(shí)針復(fù)制叉“陷阱”DNA拓?fù)涿涪虻谒墓?jié)真核細(xì)胞DNA復(fù)制真核DNA比原核DNA大的多，復(fù)制的主要過程相同；主要差異在于復(fù)制的調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期的關(guān)系上。復(fù)制原點(diǎn)——自體復(fù)制順序（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）或稱復(fù)制子。單倍體酵母細(xì)胞17條染色體中約有400個(gè)ARS因子。所有真核細(xì)胞復(fù)制起始需要一個(gè)多亞基蛋白ORC（原點(diǎn)識別復(fù)合物）。DNA聚合酶——DNA聚合酶α；也是多亞基蛋白；但無校對功能。DNA聚合酶ε——類似于原核細(xì)胞DNA聚合酶Ⅰ。單鏈結(jié)合蛋白——RFA，類似于原核細(xì)胞SSB蛋白。本章思考題中心法則，復(fù)制子，復(fù)制叉，多復(fù)制子DNA連接酶，岡崎片段，DNA的半不連續(xù)復(fù)制，前導(dǎo)鏈，滯后鏈，引物合成酶，復(fù)制體，錯(cuò)配修復(fù)，直接修復(fù)，切除修復(fù)，重組修復(fù)，應(yīng)激反應(yīng)，易錯(cuò)修復(fù)DNA的半保留復(fù)制；舉一例實(shí)驗(yàn)說明之。DNA聚合酶的反應(yīng)特點(diǎn)。大腸桿菌DNA聚合酶I的特點(diǎn)，比較聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的性質(zhì)。試述DNA聚合酶Ⅲ的作用。真核生物DNA聚合酶的種類和性質(zhì)第五節(jié)DNA損傷后修復(fù)簡介一、錯(cuò)配修復(fù)CTCGAGTAGCATCTGC5′3′AGCTAGCTAGTAGCT3′5′GCH3交感順序GATC中A被甲基化甲基化的是模板鏈！CTCAAGTAGCATCTGC5′3′AGCTAGCTAGTAGCT3′5′GCH3CH3親代DNA復(fù)制如果有錯(cuò)配的堿基那么是哪條鏈出錯(cuò)？修復(fù)的應(yīng)該是哪條？未甲基化的是新合成鏈！堿基錯(cuò)配堿基錯(cuò)配錯(cuò)配修復(fù)的一定是新合成的子鏈！而且錯(cuò)配堿基哪怕在甲基化A的1000個(gè)b以外！交感順序GATC中A被甲基化交感順序GATC中A被甲基化CH3C