人類致病基因的鑒定

人類致病基因的鑒定

1/1592人類致病基因的鑒定第一節(jié)：人類遺傳病的概述第二節(jié):鑒定致病基因的原理和策略

第三節(jié)：疾病基因克隆

本章重點(diǎn)內(nèi)容提示：人類遺傳病的概述，遺傳病的主要類型，單基因病的分子生物學(xué)，克隆疾病相關(guān)基因及基因的功能研究。FⅧ基因的克隆（功能克?。珼MD基因的克?。ǘㄎ豢寺。?023/2/2

人類基因組計劃之后，人類基因組研究的重心正在由“結(jié)構(gòu)”向“功能”轉(zhuǎn)移，一個以基因組功能研究為主要內(nèi)容的所謂“后基因組時代”(post-genomics)，即功能基因組(functionalgenomics)時代已開始。獲取基因的功能信息，即與人類重大疾病和重要生理功能相關(guān)的基因信息-----克隆疾病相關(guān)基因及基因的功能研究。2023/2/24/1592023/2/2

所有人類致病基因?qū)⒑芸毂欢ㄎ辉谌旧w的某個區(qū)域。這樣，可從某局部的序列片段中篩選出致病基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析，也就是定位候選克隆及鑒定。

不是所有的基因都有鑒定的必要，只需要鑒定編碼蛋白質(zhì)的基因。這些基因被定義為一定會影響表現(xiàn)型，可能通過間接途徑影響編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)水平或是影響編碼基因mRNA的加工和穩(wěn)定性，引起表型的異常改變---遺傳病。2023/2/25/1592023/2/2

基因定位(genemapping)：

利用一定的方法將一個基因確定到染色體上的實際位置上。1911年，Wilson將紅綠色盲基因定位到X染色體。開創(chuàng)了人類基因定位的先河。1968年，Duffy血型基因定位于1號染色體。首次在常染色體上進(jìn)行的基因定位?；蚩寺?genecloning)：用一定的方法把不同位點(diǎn)上的基因分離出來。2023/2/26/1592023/2/2一、人類遺傳病的概述

遺傳病(GeneticDisease)：是指遺傳物質(zhì)發(fā)生突變所引起的疾病，稱為遺傳病。特點(diǎn)：遺傳物質(zhì)突變；垂直傳遞；終生性。細(xì)胞核基因組遺傳物質(zhì):

線粒體基因組2023/2/27/1592023/2/2突變

生殖細(xì)胞（或受精卵）→遺傳后代突變

體細(xì)胞：引起當(dāng)代個體產(chǎn)生疾病,

不傳下一代，體細(xì)胞→體細(xì)胞傳遞.

遺傳病的發(fā)病既有遺傳基礎(chǔ)，又有環(huán)境因素，遺傳因素提供了疾病產(chǎn)生的遺傳背景，環(huán)境因素促使疾病表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀和體癥。二者作用的大小則要具體分析，如圖。2023/2/28/1591234遺傳因素環(huán)境因素1.遺傳因素>決定作用,先天聾啞,甲型血友病;2.遺傳因素>主要,環(huán)境因素>誘導(dǎo),苯丙酮尿癥;3.遺傳因素和環(huán)境因素雙重作用,哮喘(80%),消化性潰瘍(37%);4.環(huán)境因素>決定作用,外傷等.(傳染性疾病)?發(fā)病受環(huán)境因素不同程度影響2023/2/2在了解遺傳病概念的基礎(chǔ)上，區(qū)別：1）遺傳病與先天性疾病(Congenitaldisease)

先天性疾病是指出生時既表現(xiàn)出來的疾病。大多數(shù)遺傳病都是先天的，出生前致病基因已經(jīng)表達(dá)。而某些疾病在出生后并不表現(xiàn)，當(dāng)發(fā)育到一定年齡Gene才表達(dá)，如成年型多囊腎病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)，確實是遺傳病。

某些先天畸形，如海豹式嬰兒，反應(yīng)停（Thalidomide）事件。2023/2/210/1592023/2/211/1592023/2/2

1962年，“反應(yīng)?！痹跉W洲令1.2萬名嬰兒終身致殘，4000多名患兒在一歲前夭折。

2023/2/212/1592023/2/22）遺傳病與家族性疾病(Familialdisease)

大多數(shù)遺傳病具有家族性，而某些散發(fā)性疾病確屬遺傳病，如某些AR，僅有先癥者發(fā)病。2023/2/213/1592023/2/2遺傳病的主要類型

Thehereditarydisease'smaintype

從遺傳學(xué)角度分類，遺傳病包括：1、單基因病

涉及一對主基因所導(dǎo)致的疾病。

AR——先天聾啞

AD——并指、多指癥

XR——紅綠色盲

XD——抗VD佝僂病2、多基因病

涉及多對（二對以上）基因和環(huán)境共同作用所導(dǎo)致的疾病。如；唇裂、精神分裂癥、高血壓等。2023/2/214/1592023/2/23、染色體病

染色體異常引起的疾病。

數(shù)目異常常染色體——21三體綜合征性染色體——Turner綜合征結(jié)構(gòu)異常常染色體——5p-，貓叫綜合征性染色體——脆性X染色體綜合征4、體細(xì)胞遺傳病——腫瘤5、線粒體病——Leber視神經(jīng)?。–核外基因組）2023/2/215/1592023/2/2

一）染色體病Chromosomedisease

概念：由于染色體的數(shù)目、結(jié)構(gòu)畸變所引起的疾病,稱為染色體病。染色體是基因的載體，共有24種染色體：

包括1～22號常染色體和X、Y染色體，其中含有2～2.5萬個基因、2.8х109bp(基因組)。最大的1號染色體約有250Mb，最小的21號染色體約有50Mb，可見一個染色體上有上千個基因。染色體除了DNA以外還有RNA、組蛋白、非組蛋白等組成。2023/2/216/1592023/2/2染色體數(shù)目改變、微小結(jié)構(gòu)畸變，都能引起許多基因增加或缺失，結(jié)果導(dǎo)致染色體異常綜合征。染色體異常綜合征的主要表現(xiàn)是:多發(fā)畸形、生長發(fā)育遲緩、智力低下，特征性皮紋改變等。目前記載已有100多種染色體綜合征。2023/2/217/1592023/2/2染色體異常的臨床后果

自發(fā)流產(chǎn)在流產(chǎn)兒中進(jìn)行染色體研究表明，大約50%或更多的自發(fā)流產(chǎn)兒有嚴(yán)重的染色體異常。幾乎涉及到所有的染色體，但較為集中在某些染色體的改變。

如：X染色體、13、18、14、和21。

包括三體性、三倍體、四倍體、及單倍體等。2023/2/218/1592023/2/2出生缺陷

染色體異常引起的第二大臨床后果是出生缺陷，染色體的改變不同，臨床表現(xiàn)也不盡相同。

但普遍的特點(diǎn)是：生長發(fā)育遲緩（growthretardation）智力低下（mentalretardation）特征性異常體征（specificsomaticabnormalities）2023/2/219/1592023/2/2

人類染色體：每一種生物都具有恒定的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)。一個體細(xì)胞中全部染色體組成就稱為核型.

正常男性核型為正常女性核型為

46，XY

46，XX2023/2/220/1592023/2/246,XY2023/2/221/1592023/2/246,XX2023/2/222/1592023/2/2（一）染色體分析技術(shù)：

染色體顯帶技術(shù)

①

G顯帶---1971年建立，用胰蛋白酶處理后，Giemsa染色，可見深淺交替的帶，Q帶的亮帶處正好是G帶的深染處。

常規(guī)G顯帶：320～550條帶。2023/2/223/1592023/2/224顯帶方法：

G-顯帶：是最常用的方法。標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶處理后，應(yīng)用Giemsa染色，鏡檢、分析,顯示深染和淺染相間的帶紋。2023/2/224/1592023/2/2G-banding界標(biāo)landmark區(qū)region帶bands2023/2/225/1592023/2/2

②Qbanding---1968年建立，用熒光染料處理后，在熒光顯微鏡下觀察，可見明暗交替的帶。③Rbanding---鹽溶液（磷酸二氫鈉等）處理后，Giemsa染色，深淺帶正好與G帶相反。一般用于觀察染色體末端。④Cbanding---用氫氧化鈉或氫氧化鋇預(yù)處理后，Giemsa染色，結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)（著絲粒、副縊痕、Y染色體長臂等）染成深色。2023/2/226/1592023/2/2染色體高分辨顯帶(highresolutionbandingchromosome,HRBC)：

70年代后期建立，一般顯帶是320條帶，HRBC是550條帶→850條→1000多條。在細(xì)胞分裂晚前期、早中期收集染色體，獲得更長的染色體，然后顯帶。2023/2/227/1592023/2/2282023/2/228/1592023/2/2※

人類細(xì)胞遺傳學(xué)研究新進(jìn)展：（1）微細(xì)胞遺傳學(xué)---應(yīng)用HRBC技術(shù)研究染色體微細(xì)結(jié)構(gòu)改變與遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性。一般能檢測到4500Kb以上的DNA改變。（2）分子細(xì)胞遺傳學(xué)---近年來進(jìn)展快，應(yīng)用較為廣泛。以分子水平研究染色體結(jié)構(gòu)畸變的遺傳效應(yīng)、疾病。2023/2/229/1592023/2/2原位雜交----熒光原位雜交（FISH），把某一DNA片斷（探針，基因）精確定位到染色體特定區(qū)帶。染色體涂染---染色體特異性DNA作為探針池（某號染色體、或某區(qū)帶染色體），用非同位素標(biāo)記（如生物素），與靶細(xì)胞染色體進(jìn)行原位雜交，以帶有熒光的抗生物素蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后檢測特異區(qū)段的熒光雜交信號。染色體易位檢測時用兩種不同染色涂染不同染色體。2023/2/230/1592023/2/21)單色FISH

2023/2/231/1592023/2/221-三體核型2023/2/232/1592023/2/221三體FISH診斷2023/2/233/1592023/2/2

2)雙色及多色FISH

應(yīng)用1號（spectrumRed標(biāo)記，紅色）和12號染色體探針（spectrumGreen標(biāo)記，綠色）進(jìn)行雙色FISH；

2023/2/234/1592023/2/2應(yīng)用10號（spectrumRed標(biāo)記，紅色）和2號染色體探針（spectrumGreen標(biāo)記，綠色）進(jìn)行雙色FISH。2023/2/235/1592023/2/2多色FISH（24種染色）2023/2/236/1592023/2/23)比較基因組雜交（ComparativeGenomicHybridization,CGH）

待測基因組DNA和正常參照基因組DNA，分別用不同的非同位素標(biāo)記（切口平移法、隨機(jī)引物法），以1：1混合制成探針，在正常人外周血染色體標(biāo)本上進(jìn)行原位抑制雜交，分別以不同熒光染料標(biāo)記的蛋白進(jìn)行檢測。2023/2/237/1592023/2/2

例如：正常DNA----紅色熒光標(biāo)記腫瘤-----綠色熒光標(biāo)記那么紅（正常）/綠（腫瘤）熒光比值定量檢測（用電腦彩色圖像分析系統(tǒng)）熒光強(qiáng)度,由此判斷腫瘤DNA的擴(kuò)增或缺失等基因拷貝數(shù)的變化.2023/2/238/1592023/2/22023/2/239/1592023/2/2402023/2/240/1592023/2/2（二）染色體機(jī)能----轉(zhuǎn)錄活性和染色體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系哺乳動物染色體有如下兩個生物學(xué)功能：（1）保持遺傳物質(zhì)恒定---DNA復(fù)制后，經(jīng)有絲分裂均分到子細(xì)胞中去。（2）世代傳遞來自于雙親的同源染色體之間發(fā)生互換（減數(shù)分裂），使遺傳物質(zhì)重組（父、母親的），個體間差異。2023/2/241/1592023/2/2染色體的機(jī)能依賴于著絲粒、端粒、復(fù)制起點(diǎn)三種元件，在酵母人工染色體的制備成功就說明這一點(diǎn)。

酵母人工染色體（Yestartificialchromosome,YAC）---具有相當(dāng)于有功能的著絲粒、兩個端粒、復(fù)制起點(diǎn)的特殊的克隆載體，能克隆200～2000Kb長度。

著絲粒---細(xì)胞分裂時姐妹染色單體之間分離，同源染色體之間分離起重要作用，沒有著絲粒的染色體片斷在分裂中丟失。有多個染色體特異的DNA序列組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。2023/2/242/1592023/2/2

端粒---由DNA和蛋白質(zhì)組成的特殊結(jié)構(gòu)，位于真核生物染色體末端。其作用是：

①保持染色體的完整---失去端粒后染色體末端非常不穩(wěn)定，容易與其他染色體切斷形成的切端之間相接、融合形成易位染色體。端粒結(jié)合蛋白能識別端粒3,突出末端，起保護(hù)作用。②保證染色體末端DNA復(fù)制的完全，復(fù)制到DNA鏈終端。2023/2/243/1592023/2/2③維持核內(nèi)三維結(jié)構(gòu)及對染色體配對起作用（染色體末端局限性存在于核周邊）端粒的結(jié)構(gòu)---進(jìn)化過程中高度保守，由高度重復(fù)序列組成，在人類是由(TTAGGG)n組成，在端粒酶的作用下復(fù)制。端粒酶（telomerase）---由RNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，以核內(nèi)RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶。細(xì)胞內(nèi)以RNA為模板合成DNA，延伸端粒中富含TG的DNA領(lǐng)頭鏈，以DNA聚合酶合成另一條鏈。因此，總是有3’突出單鏈末端，端粒的長度由遺傳控制。2023/2/244/1592023/2/2452023/2/245/1592023/2/2

復(fù)制起點(diǎn)---

開始DNA復(fù)制的位點(diǎn)，維持染色體拷貝數(shù)。在哺乳動物數(shù)十個Kb間有個開始復(fù)制起點(diǎn)，由復(fù)制起始的特異序列組成。一個細(xì)胞周期只復(fù)制一次，即復(fù)制一次C分裂一次。轉(zhuǎn)錄活性與染色質(zhì)/體結(jié)構(gòu)相關(guān)---

細(xì)胞分裂間期染色質(zhì)可以分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，常染色質(zhì)著色淺，螺旋化程度低，有轉(zhuǎn)錄活性。

2023/2/246/1592023/2/2

功能異染色質(zhì)異染色質(zhì)

結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，X染色質(zhì)屬于功能異染色質(zhì)，發(fā)育過程中選擇性地凝縮形成。

結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是在各種細(xì)胞中總是處于凝縮狀態(tài)，是高度重復(fù)的DNA，沒有轉(zhuǎn)錄活性，常見于著絲粒、端粒，維持染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前FISH研究結(jié)果看到人類基因80%位于R帶，僅有20%位于G帶，CpG島多數(shù)在R帶。2023/2/247/1592023/2/2X染色質(zhì)屬于功能異染色質(zhì)2023/2/248/1592023/2/2492023/2/249/1592023/2/2Lyon假說1.女性兩條染色體中一條處于異固縮狀態(tài)——X染色質(zhì)（Barrbody）。2.胚胎發(fā)育早期—第16天開始異固縮。3.異固縮染色體是隨機(jī)的。2023/2/250/1592023/2/2需要說明的問題1）如果一個有缺失的X染色體，優(yōu)先失活；2）常染色體和X染色體平衡易位的個體中，正常的X染色體優(yōu)先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，約1/3的gene逃避失活，已知>16個基因逃避失活；4）體細(xì)胞X失活是永久的，但在生殖細(xì)胞發(fā)育中，失活是可逆的；5）C中只有一條X染色體有活性，其他均以失活狀態(tài)存在；2023/2/251/1592023/2/2

X染色體和Y染色體---

Y染色體上SRY基因（Yp11.3）決定男性性別，盡管有兩個以上X染色體，但只要有Y染色體其表型為男性。X和Y染色體在減數(shù)分裂時配對，兩者的短臂末端具有同源性，稱為擬常染色質(zhì)區(qū)，是減數(shù)分裂時配對的部位。2023/2/252/1592023/2/2（三）染色體異常與疾病概念：由于染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常引起的疾病就稱為染色體病。數(shù)目異常：整倍體---染色體整組的變化，即3n、4n，常見于夭折的胚胎或腫瘤細(xì)胞中，這樣的個體即使生下來也不能生存很長時間。非整倍體---不是整組的變化而是某號染色體增或減，2n+1,2n-1的改變。▲數(shù)目異常產(chǎn)生原因---染色體不分離，染色體丟失，核內(nèi)復(fù)制，還有雙受精。

2023/2/253/1592023/2/2染色體異常

數(shù)目異常：二倍體diploid

2n，一個體細(xì)胞中染色體數(shù)。46，XX。46，XY。整倍體euploid

n或n的倍數(shù)。23、46、69-非整倍體aneuploid

不是n或n的倍數(shù)。增加或減少1條或幾條。三體性trisomy

某號染色體多一個拷貝，如21三體，47，XX，+21。單體性monosomy

某號染色體少一個拷貝，如Turner綜合征，45，X。2023/2/254/159三倍體形成原因：雙雌受精和雙雄受精2023/2/223，X23，X23，X23，X23，X23，Y69,XXY69,XYY69,XXX69,XXY69,XXX23，X23，X23，X23，X23，X23，Y23，Y23，X23，YA.69,XXX的形成B.69,XXY的形成B.69,XYY的形成A.69,XXX的形成C.69,XXY的形成2023/2/255/1592023/2/2四倍體形成原因：核內(nèi)復(fù)制和核內(nèi)有絲分裂2023/2/256/1592023/2/2

非整倍體是不分離（non-disjunction）的結(jié)果，即在細(xì)胞分裂時染色體不能正常分開。

減數(shù)I不分離

減數(shù)分裂不分離不分離減數(shù)II不分離

有絲分裂不分離（卵裂不分離）2023/2/257/1592023/2/2▲單親二倍體：所有染色體（2n）來自父或母單方的二倍體，在胚胎時夭折。父源的就形成葡萄胎，母源的就形成卵巢畸胎瘤。

這是由于遺傳印記，即父源的和母源的基因表達(dá)不同，二倍體都來自單親的就不可能發(fā)育成個體?！鴨斡H二體型：一對同源染色體都來自父或母方，一般三體型丟失一條后其數(shù)目正常，但都來自于單親。2023/2/258/1592023/2/2

常染色體病染色體?。盒匀旧w病

常染色體病---由于常染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常引起的病。最常見的是唐氏綜合癥（Downsyndrome,DS，21三體，先天愚型）。

2023/2/259/1592023/2/2

DownSyndrome2023/2/260/1592023/2/2Down（唐氏）綜合征患者2023/2/261/1592023/2/23）核型2023/2/262/1592023/2/2性染色體病---

由于性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常引起的疾病。最常見的是：Turner綜合癥.45,XKlinfilter綜合癥。47,XXY其次是脆性X染色體綜合癥。2023/2/263/1592023/2/2Klinfilter綜合征47,XXY2023/2/264/1592023/2/2Turner綜合征45,X2023/2/265/1592023/2/2結(jié)構(gòu)異常：染色體斷裂以后形成的斷片變位重接就產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)異常。包括缺失、重復(fù)、倒位、易位、插入、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等。一般4Mb以上的改變才能被識別（光鏡下）。染色體結(jié)構(gòu)異常類型：2023/2/266/1592023/2/21、缺失deletion-del2、易位translocation-t相互易位羅伯遜易位Robertsoniantranslocation-rob3、等臂染色體isochromosome-iso4、插入insersion-ins5、倒位inversion-inv6、重復(fù)duplication-dup7、雙著絲粒染色體dicentricchromosome-dic8、環(huán)狀染色體ringchromosome–r

2023/2/267/1592023/2/2682023/2/268/1592023/2/2692023/2/269/1592023/2/2

D/DD/GG/G1314羅伯遜易位Robertsoniantranslocation-rob2023/2/270/1592023/2/22023/2/271/1592023/2/2雙著絲粒染色體dicentricchromosome-dic2023/2/272/1592023/2/2環(huán)狀染色體ringchromosome-r2023/2/273/1592023/2/2脆性X染色體綜合征（fragileXchromosome，fraX）

位于Xq27.3處染色體呈細(xì)絲樣，易斷裂—脆性部位。該病主要男性發(fā)病，發(fā)病率高（僅次于21三體），發(fā)病率為男性的1/1250。臨床癥狀—智力低下（中度），頭大，長臉，下頜大，大耳，大睪丸，語言障礙。近年分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展：克隆分離FMRIgene（主要在腦中表達(dá)），Xq27.3，38kb，17個外顯子。2023/2/274/1592023/2/22023/2/275/1592023/2/22023/2/276/159脆性X染色體綜合征家系2023/2/277/1592023/2/2發(fā)病機(jī)制：5′端第1外顯子非編碼順序中存在（CGG）n。正常狀態(tài)：

n=6～46，當(dāng)n〉52減數(shù)分裂時不穩(wěn)定，傳遞過程中重復(fù)拷貝數(shù)增加。前突變（premutation）：n=60～2005′端非甲基化，無臨床表現(xiàn)（攜帶者）。2023/2/278/1592023/2/2突變：當(dāng)n〉230，達(dá)數(shù)百，數(shù)千，有臨床癥狀

5′端高度甲基化不穩(wěn)定

轉(zhuǎn)錄停止不同細(xì)胞中n數(shù)不同無FMR1mRNA及蛋白嵌合體2023/2/279/1592023/2/2攜帶者：大部分是n=50～230（前突變）

FMR1仍有表達(dá)，但傳遞時不穩(wěn)定，尤其母親更不穩(wěn)定

子女

當(dāng)n〈70突變概率20%n〉90突變概率99%

女性的突變主要由母親前突變傳來，而不是父親，在家系傳遞過程中，拷貝數(shù)逐漸增多，表現(xiàn)為遺傳早現(xiàn)，即隨著傳代發(fā)病年齡提早，病情加重。2023/2/280/1592023/2/2812023/2/281/1592023/2/282/1592023/2/283/1592023/2/2二）單基因病的分子生物學(xué)

（monogenicdisease）

1.單基因遺傳病的概念、種類：

由一對主基因所決定的性狀或疾病稱為單基因遺傳病。目前已知約有6000多種，其中約3000多種與疾病相關(guān)。根據(jù)基因的顯、隱性，位于1～22號常染色體上還是X染色體上，把單基因遺傳病分為如下4種：2023/2/284/1592023/2/2AD---占半數(shù)以上，一般來講結(jié)構(gòu)蛋白異常，包括完全顯性、不完全顯性、共顯性、不規(guī)則顯性、延遲顯性。AR---約占36%，一般是酶蛋白異常。XR---10%以下。XD---較少2023/2/285/1592023/2/2常染色體顯性遺傳（AD）例1：Huntingtondisease（HD）

亨廷頓舞蹈癥是一種遺傳神經(jīng)退化疾病，主要病因是患者HD基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團(tuán)。

雜合體多在30—40歲發(fā)病，致病基因定位于4p16.3。正常n=25～39分子機(jī)制，（CAG）n擴(kuò)展

患者n=42～812023/2/286/1592023/2/2

例2：脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)

(Spinocerebellarataxias,SCAs)

神經(jīng)退化性疾病,AD，臨床癥狀—遲發(fā)性共濟(jì)失調(diào)，走路不穩(wěn)，易跌，步態(tài)蹣跚，兩手笨拙，震顫，不能精細(xì)動作；喝水嗆；構(gòu)音障礙，眼震顫等。

SCA已發(fā)現(xiàn)有20幾種亞型—基因座異質(zhì)性發(fā)病機(jī)制與三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展的動態(tài)突變相關(guān)。例如：SCA1基因編碼區(qū)5′端（CAG）n

正常：n=17～36

發(fā)病:n〉432023/2/287/1592023/2/2ⅠⅡⅢⅣⅤ60歲發(fā)病70歲死亡121231234567891066歲死亡45歲發(fā)病62歲死亡50歲發(fā)病56歲死亡45歲發(fā)病26歲死亡19歲發(fā)病1234567891011121314151617181920212223242526272812345678910111213141565歲50歲發(fā)病48歲36歲發(fā)病36歲因肺結(jié)核死亡

常染色體顯性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（SCA）家系系譜

1遺傳方式：AD。2延遲顯性:V代15個子女無一發(fā)病。

3早現(xiàn)遺傳：Ⅳ3、28（36、26歲）>Ⅲ（>

45歲）2、4、5、9。4遺傳印記：Ⅲ5(男)后代患病多，Ⅲ4（女）后代患病少。2023/2/288/1592023/2/2動態(tài)突變（dynamicmutation）:

某些遺傳性疾病與三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)的擴(kuò)展有關(guān)，三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)在正常情況下有一定的變異范圍，而擴(kuò)展時就表現(xiàn)為疾病，這種突變不穩(wěn)定，其拷貝數(shù)與病情正相關(guān)。例如：強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥（CTG）n，3′非編碼區(qū)。脆性X染色體綜合征（CGG）n，

5′非編碼區(qū)。

HD（CAG）n，

5′編碼區(qū)。

SCA（CAG）n，

5′編碼區(qū)。2023/2/289/1592023/2/2

HD早現(xiàn)遺傳（anticipation）：

一些遺傳病表現(xiàn)出連續(xù)世代傳遞中發(fā)病年齡提早，病情也加重，這種現(xiàn)象就稱為早現(xiàn)遺傳。這與動態(tài)突變中三核苷酸拷貝數(shù)的擴(kuò)展程度有關(guān)。

父親遺傳—發(fā)病早（20歲以前）HD----病情嚴(yán)重

母親遺傳—約在40歲以后發(fā)病，

----病情較輕2023/2/290/1592023/2/2遺傳印跡（Geneticimprinting）：

雙親的基因或染色體存在功能上的差異，因而基因來自父方或母方而產(chǎn)生不同表現(xiàn)型的現(xiàn)象。這是由于生殖細(xì)胞分化過程中受到不同修飾的結(jié)果。例如：15p11-13缺失

父源染色體缺失—Prader-will綜合征母源染色體缺失—Angelman綜合征2023/2/291/1592023/2/2※

分子病以及先天性代謝?。?/p>

分子病（moleculaerdisease）的概念是1949年P(guān)auling首次提出，對HbS患者的血紅蛋白進(jìn)行電泳檢測時發(fā)現(xiàn)，患者和正常人的Hb泳動速度不同，考慮是由于Hb的分子結(jié)構(gòu)不同所致，由此提出分子病的概念。2023/2/292/1592023/2/2分子病包括：血紅蛋白病----異常血紅蛋白?。ńY(jié)構(gòu)異常）約有600多種地中海貧血（合成速率下降）包括α地貧和β地貧。血漿蛋白異常免疫蛋白異常受體蛋白異常酶蛋白異常---先天性代謝病2023/2/293/1592023/2/2先天性代謝病:遺傳性酶缺陷導(dǎo)致代謝異常?；蛉毕荨傅鞍桩惓！x異?！膊?

例如：苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninehydroxyrase,PAH）遺傳性缺陷所致，AR,12q24,發(fā)病率為1/16500，由于PAH基因缺陷苯丙氨酸代謝受阻，導(dǎo)致旁路代謝開放副產(chǎn)物累積，造成白化癥（酪氨酸缺乏），苯丙酮尿，智力低下（腦積夜中含有大量的苯丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物，使智力發(fā)育受限）。2023/2/294/1592023/2/22.

X-連鎖隱性遺傳?。撼Ｒ姷挠校?/p>

血友病

DMDG6PD

紅綠色盲等。2023/2/295/1592023/2/2血友病(hemophiliaA)

以血友病為例介紹疾病的認(rèn)識過程及疾病的分子生物學(xué)研究過程。

血友病是分子遺傳學(xué)研究基因定位、基因診斷、基因治療中很有意義的疾病。早在二世紀(jì)被猶太人注意----割禮后出血不止而死亡。12世紀(jì)在阿拉伯文獻(xiàn)中有記載。19世紀(jì)已注意到出血不止的原因是由于凝血緩慢。2023/2/296/1592023/2/2

1）

19世紀(jì)歷史上最著名的血友病家系---

英國王室出現(xiàn)的血友病，波及歐洲各王室。

Victoria女王（1820~1901），8歲時其父去世，被定為王位繼承者，其父母家系中無血友病病史，后來研究認(rèn)為是新生的突變。她共生育8個子女，三個兒子中一個是血友病患者，五個女兒中兩個是攜帶者，她們的女兒分別嫁到俄羅斯、德國、西班牙等多個歐洲國家。以后生了血友病兒子。結(jié)果現(xiàn)今英女王是Vctoria正常兒子的后裔，因此其后代中無血友病患者，英國王室不再受血友病之害。然而通過攜帶者女兒把血友病傳遞到歐洲多個王室。2023/2/297/1592023/2/298“Royaldisease”

2023/2/298/1592023/2/22）

20世紀(jì)Mendel遺傳規(guī)律的應(yīng)用----

發(fā)現(xiàn)血友病是XR,男性患者，女性攜帶者。3）1911~1937年----

探索血友病凝血缺陷的早期努力。

通過臨床實驗發(fā)現(xiàn)血友病患者的血液----凝血時間延長，但不清楚是凝血第幾因子的缺乏。4）1950~1983年----

命名因子Ⅷ，并分離出來。2023/2/299/1592023/2/21962年,明確A型是第Ⅷ因子缺乏，B型是第Ⅸ因子缺乏所致。血友病中5/6是A型，1/6是其他因子缺乏，其中主要是B型。※1965年取得很大進(jìn)展凝血瀑布假說----FⅧ是一個輔助因子，凝血過程中FⅧ增強(qiáng)了FⅨa因子對FⅩ因子激活的作用，可見在臨床上A型與B型無法區(qū)別。

2023/2/2100/1592023/2/2血液凝固的級聯(lián)式過程2023/2/2101/1592023/2/2※

FⅧ因子和血管性假血友病(vonwillebrand’sdisease,VWD)

VWD是由于VWF（Vonwillebrand’sfactor,血管性假血友病因子）缺乏所致。

VWD是50年代首先被描寫的常染色體顯性遺傳病，是由于VWF遺傳性缺陷所致。2023/2/2102/1592023/2/2

VWF—已證明是FⅧ的受體，血漿中FⅧ是大分子復(fù)合物—即小分子量部分的FⅧ促凝活性和大分子量部分的VWF兩者結(jié)合所組成。FⅧ促凝活性（Ⅷ：C）缺乏是血友病A的發(fā)病原因，F(xiàn)Ⅷ促凝活性只占FⅧ復(fù)合物中的1%，具有凝血活性作用，血漿中含量約為50μg/L。Ⅷ：C的正常值為50～150%，小于正常的2%為重型，正常的2～5%為中型，正常的5～25%標(biāo)記為輕型，正常的25～50%為亞臨床型。VWF基因定位于12P12～Pter,VWD是AD遺傳。1979年才把FⅧ和VWF純化出來。2023/2/2103/1592023/2/2血友病的治療---人的血漿中FⅧ含量低，因此在動物（豬、牛）血中提取,輸給患者，可能產(chǎn)生抗體，誘發(fā)其他病，但是救了許多生命。即血漿化學(xué)分離，商品化，問題是出現(xiàn)了并發(fā)癥，乙肝病毒、艾滋病病毒感染。1979年～1983年之間大部分FⅧ提取物被污染上了HIV，對于血友病的治療是悲劇性的結(jié)果。后來用滅活這些病毒的方法有了些好轉(zhuǎn)。2023/2/2104/1592023/2/25）

1982年~1984年血漿提純

FⅧ提取高純度的FⅧ而獲得專利，隨后設(shè)想能否用生物工程的方法制備FⅧ，既提高產(chǎn)量也可以避免病毒等污染。2023/2/2105/1592023/2/2幾個研究小組同時進(jìn)行研究：

把純化的FⅧ經(jīng)胰蛋白酶消化成不同的多肽片斷，通過色譜法分離不同多肽片斷，將多肽片斷進(jìn)行氨基酸測序，以此為依據(jù)設(shè)計合成相應(yīng)的寡核苷酸探針（考慮密碼的兼并性），應(yīng)用此探針篩選基因組文庫，再經(jīng)基因組文庫步移法克隆全基因?；蛉L為186Kb,含26個外顯子。用如上探針篩選肝臟的cDNA文庫，就能得到FⅧ基因的cDNA。2023/2/2106/1592023/2/21984年12月在Nature雜志上發(fā)表了如上研究結(jié)果。然后把FⅧcDNA克隆于表達(dá)載體，研究分析基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。FⅧ基因：位于Xq28,全長186Kb,占X染色體的0.1%,含有26個外顯子和25個內(nèi)含子，其中第22內(nèi)含子長達(dá)32Kb。mRNA9.0Kb。2023/2/2107/1592023/2/2FⅧ蛋白：由cDNA推測的FⅧ蛋白---含19個aa的信號肽和2332aa組成，主要在肝臟中合成，分泌時信號肽斷開后成為成熟的氨基末端，由A1A2BA3C1C2

等區(qū)域構(gòu)成(同源性來分)。C區(qū)域---FⅧ功能區(qū)。B區(qū)域---由外顯子14編碼，與已知蛋白不同源，在活化的FⅧ中被剪切掉B區(qū)域，推測可能是被加工后的mRNA反轉(zhuǎn)錄后再整合進(jìn)去的。2023/2/2108/1592023/2/21092023/2/2109/1592023/2/26）如何檢測血友病攜帶者血液中FⅧ水平能檢測大多數(shù)攜帶者，但攜帶者可以有正常的FⅧ水平，最好的方法是基因診斷。1987年首次應(yīng)用RFLP連鎖分析進(jìn)行了首例產(chǎn)前基因診斷。2023/2/2110/1592023/2/2

奧大利亞一位醫(yī)生的妻子是個血友病攜帶者（家族性），當(dāng)他閱讀了《Nature》雜志上發(fā)表的論文后，來信懇求作產(chǎn)前基因診斷.經(jīng)過BclⅠ/RFLP連鎖分析，確定胎兒是正常男性（核型分析判斷性別為男性），連鎖分析判斷未得到帶有致病基因的染色體，其結(jié)果發(fā)表在Lancent雜志上。2023/2/2111/1592023/2/2

內(nèi)含子18中BclⅠ多態(tài),Southern雜交分析結(jié)果：1.2Kb(1165bp)占27%，

0.9Kb(879bp)占73%，雜合子頻率:2pq=2×0.27×0.73=0.42(一般在RFLP的情況下小于0.5)。2023/2/2112/1592023/2/2113BCLI多態(tài)2023/2/2113/1592023/2/27）1986年首次檢測引起甲型血友病的點(diǎn)突變

TaqⅠ/RFLPSouthern檢測（以cDNA為探針）結(jié)果，患者出現(xiàn)異常帶，進(jìn)一步克隆測序判定，外顯子24中密碼子2209的CGA→TGA,結(jié)果精氨酸變成了終止密碼。（迄今已發(fā)現(xiàn)80多種點(diǎn)突變、6種插入、7種小缺失、及60多種大缺失。）

2023/2/2114/1592023/2/28)1987～1992年

PCR技術(shù)的應(yīng)用，檢測到很多種突變，也檢測到多種多態(tài)。9）1992年缺失檢測。10）神秘的內(nèi)含子22被闡明，其中有2個小基因，分別叫F8A和F8B，通過CpG島發(fā)現(xiàn)，其功能還沒有搞清楚，已被檢測到的蛋白質(zhì)中沒有與該基因閱讀框架相應(yīng)的蛋白質(zhì)。2023/2/2115/1592023/2/211）1990年～1993年

通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)FⅧ---將FⅧ基因重組于表達(dá)載體，把重組體轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞中表達(dá)，使其產(chǎn)生FⅧ，1～2mg/升。首先在狗中做實驗，然后用于人。第一批接受治療的嚴(yán)重血友病患者，其止血效果非常好，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不良表現(xiàn)，但后來注意到幾乎30%的人產(chǎn)生抗體。目前市售的FⅧ有---血漿來源的FⅧ或FⅧ復(fù)合物、基因工程生產(chǎn)的。2023/2/2116/1592023/2/212）1995年~2002年①

確定所有突變基因型，又有效阻止這些突變②

推動基因治療③

解答蛋白產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)④

闡明蛋白功能的機(jī)制，研究基因的進(jìn)化上述為認(rèn)識遺傳病的過程。

2023/2/2117/1592023/2/2假肥大型肌營養(yǎng)不良：

包括DMD（Duchennemusculardystrophy）,和BMD（Beckermusculardystrophy）,都是DMD基因缺陷所致，DMD比BMD癥狀重，發(fā)病年齡早。DMD發(fā)病率為1/3500，是神經(jīng)肌肉系統(tǒng)最常見的遺傳病，XR遺傳。一般5～6歲開始發(fā)病，雙下肢無力，上樓梯困難，Gower征（+），腓腸肌假性肥大，進(jìn)行性肌萎縮，10歲以后不能自主走路，20歲前死于呼吸、循環(huán)衰竭。2023/2/2118/1592023/2/2

部分患兒伴有不同程度的智力低下。生化檢測---血清磷酸激酶（CPK）升高,

乳酸脫氫酶（LDH）升高,

肌紅蛋白（Mb）升高。肌電圖-----呈典型肌源性疾病改變。2023/2/2119/1592023/2/2二、鑒定致病基因的原理和策略

人類基因組研究的重心正在由“結(jié)構(gòu)”向“功能”轉(zhuǎn)移。一個以基因組功能研究為主要內(nèi)容的所謂“后基因組時代”(post-genomics)，也即功能基因組(functionalgenomics)時代已開始。重要的是如何獲取基因的功能信息，即與人類重大疾病和重要生理功能相關(guān)的基因信息，所以克隆疾病相關(guān)基因及基因的功能研究日益受到重視。2023/2/2120/1592023/2/2

人類基因組測序完成前，基因克隆的兩個基本方法是功能克隆和位置/定位克隆。而在人類基因組測序完成后，闡明具體的基因功能變得更加重要，基于家系的資料闡述基因功能和疾病基因組學(xué)研究還是具有不可取代的價值。多種方法可以完成對致病基因的最后的識別,但所有的途徑都集中于一個候選基因。通過鑒定一種候選基因，接著通過在患者中篩選陽性克隆驗證這是致病基因的假說。

有機(jī)體模型→數(shù)據(jù)庫調(diào)查→臨床輸入→實驗室工作→成功。2023/2/2121/1592023/2/2一）表達(dá)基因的克隆策略

基因克隆(genecloning)：是指從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA序列，再通過DNA序列擴(kuò)增形成由眾多拷貝組成的一個DNA片段群體的過程。目前，廣泛應(yīng)用于致病基因分離與克隆的策略可歸納為：定位克隆(positionalcloning)、功能克隆(Functionalcloning)、候選位置克隆(candidatepositionalcloning)等。2023/2/2122/1592023/2/21、定位克隆(positionalcloning)

定位克隆是先利用連鎖分析進(jìn)行基因定位作圖，然后進(jìn)行基因克隆，進(jìn)一步明確該基因的功能。

分析患病家系的連鎖關(guān)系確定致病基因的遺傳方式，從染色體畸變引發(fā)的疾病入手，將染色體畸變的位置作為疾病基因克隆的一個位點(diǎn)進(jìn)行分析的一種克隆策略。總體思路是：

疾病——染色體定位——基因序列——mRNA／cDNA—

蛋白質(zhì)(致病基因產(chǎn)物)。2023/2/2123/159定位克隆疾病相關(guān)基因的常規(guī)流程ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop全基因組掃描基因測序精細(xì)定位確定候選基因家系研究染色體位點(diǎn)候選基因2023/2/2伴隨人類基因組計劃的實施而發(fā)展起來的基因定位新策略。其他信息未知的情況下先染色體定位，然后進(jìn)行克隆。

染色體定位→縮小候選區(qū)域→鄰近克隆群中篩選出結(jié)構(gòu)基因→經(jīng)篩查突變來確定疾病相關(guān)基因。2023/2/2125/1592023/2/21）

染色體定位的方法（范圍較大，通常大于10Mb）（1）

連鎖分析---遺傳病的基因定位常用方法。通過家系分析尋找lod值3以上的遺傳標(biāo)記，此標(biāo)記位點(diǎn)就是該基因的候選區(qū)域。（2）雜合性丟失篩選(lossofheterozygosity,LOH)

常用于腫瘤抑制基因的定位。應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記（一般經(jīng)過細(xì)胞遺傳學(xué)分析，染色體缺失好發(fā)部位的多態(tài)標(biāo)記），對比正常組織與腫瘤組織，尋找腫瘤中好發(fā)雜合性丟失部位（圖）。2023/2/2126/15925個遺傳標(biāo)記---10個病例2023/2/2127/1592023/2/2（3）染色體異常---在一些疾病中伴隨著染色體異常，此異常部位的基因與疾病相關(guān)。例如，DMD中常見到Xp21缺失或該點(diǎn)的易位。1986年成功報道了DMD基因的定位克隆例子。（此外，還有CF、HD、多囊腎、大腸癌、乳腺癌等致病基因）。這種方法很費(fèi)事，到1995年末只有50多個基因用此法進(jìn)行克隆。2023/2/2128/1592023/2/2

2)縮小候選區(qū)域---

縮小候選染色體區(qū)域的范圍，用多態(tài)性標(biāo)記對該區(qū)域作更為精細(xì)的遺傳圖，在這個過程中遺傳分析至關(guān)重要，采取交換體分析、連鎖不平衡分析等方法盡可能縮小染色體區(qū)域定位。2023/2/2129/1592023/2/23)克隆重疊群(clonecontugs)的連接及篩選目的基因轉(zhuǎn)錄圖構(gòu)建,克隆DNA中識別基因。主要用CpG島識別、外顯子捕獲、DNA測序等方法（尋找外顯子序列特征部分）。4)突變篩查確定候選基因(致病基因)※三個定位克隆的成功例子（DMD、NF1、CF）。2023/2/2130/1592023/2/22、功能克?。‵unctionalcloning）

功能克?。菏抢靡阎誀顚?yīng)的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)氨基酸序列的信息，進(jìn)行基因定位，進(jìn)而克隆該基因。用該方法克隆基因，需要預(yù)先得知性狀對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。利用其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用cDNA作探針從人類基因組中釣出基因本身。

蛋白質(zhì)→RNA→DNA/GENE

2023/2/2131/1592023/2/21323、候選基因法（canidategeneapproach）

候選基因法無需經(jīng)過基因圖和物理圖的過程，根據(jù)某種遺傳病和特定基因分別定位于染色體的同一區(qū)域，而后在發(fā)現(xiàn)并鑒定其基因突變，則可研究此致病基因。假設(shè)某一基因為候選基因——用證據(jù)驗證假設(shè)。

1）從基因表達(dá)及機(jī)能推測候選基因：例如:胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管形成，在發(fā)育３～４周階段，表達(dá)的基因與神經(jīng)管形成相關(guān)-----神經(jīng)管形成候選基因。2023/2/2132/1592023/2/2

２）應(yīng)用疾病動物模型――動物中相關(guān)基因已知的情況下，分析人類疾病相關(guān)基因（同源基因）３）相似的人類疾病基因序列同源性和機(jī)能相關(guān)性分析――例如:某一基因?qū)儆谀骋欢嗷蚣易?。４）定位于疾病基因同樣染色體區(qū)段的基因。某一候選基因的位置正好與該疾病在染色體上定位點(diǎn)相一致。2023/2/2133/1592023/2/2４．突變篩查-------確定候選基因候選基因→患者中該基因存在突變→才能確定。大量患者、大量正常人要進(jìn)行對比檢查。

2023/2/2134/1592023/2/2二）確定表達(dá)基因序列的技術(shù)方法（1-7）1、連鎖分析與致病基因定位當(dāng)染色體上控制這些性狀的基因位點(diǎn)相距很近時，在減數(shù)分裂過程中位點(diǎn)之間發(fā)生染色體單體交叉和等位基因互換的機(jī)率較小，相鄰的基因位點(diǎn)就有較大的機(jī)會以連鎖方式傳遞給后代，即兩位點(diǎn)越近，發(fā)生染色體交叉和基因重組的可能性越小，反之越大。位點(diǎn)間的距離用重組率或重組分?jǐn)?shù)(recombina-tionfraction)進(jìn)行估計。即：重組分?jǐn)?shù)＝重組配子數(shù)/（重組配子數(shù)＋非重組配子數(shù)）2023/2/2135/1592023/2/22、利用染色體畸變進(jìn)行基因定位與分離

若發(fā)現(xiàn)某種疾病與染色體畸變直接相關(guān)，致病基因就可定位在一段相對較短的染色體變異區(qū)域。通過連鎖分析將基因分離的目標(biāo)初步定位在10～20Mb區(qū)段內(nèi)，使要分離的目標(biāo)基因大大縮小，省去了大量繁瑣的全基因組連鎖分析，大大加快了該基因的定位和分離速度。通過篩選DNA文庫、外顯子捕獲(exontrapping)和比較基因組雜交(comparativegenomehybridizatien)等表型策略獲得致病基因。2023/2/2136/1592023/2/23、cDNA選擇法

基因組圖譜繪制和基因定位克隆的常見問題是大片段基因組編碼DNA的鑒定。為解決此問題，1991年，Parimoos等首先提出了cDNA選擇法。

此法采用cDNA片段與固定在膜上的DNA進(jìn)行雜交，通過PCR回收候選cDNA。用YAC、粘?？寺U(kuò)增cDNA，進(jìn)行基因組DNA大片段編碼序列的迅速克隆。

2023/2/2137/1592023/2/2138/1592023/2/24、CpG島法

CpG島(CpGisland)是基因組DNA序列中富含C-G的DNA區(qū)域。在大規(guī)模的DNA測序中，每發(fā)現(xiàn)一個CG島，意味著在此有一個基因。利用CpG島稀有酶如SacⅡ、BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ識別其位點(diǎn)，切割基因組DNA。CpG島又稱HIF島，即用HpaⅡ酶將CpG島周圍的DNA切成許多小片段，這些序列稱為HIF序列。

用位于CpG附近的序列作探針，從總DNA文庫或cDNA文庫中得到轉(zhuǎn)錄子，鑒定表達(dá)基因。

2023/2/2139/1592023/2/2CpGisland2023/2/2140/1592023/2/2141CPG預(yù)測及引物設(shè)計2023/2/2141/1592023/2/25、基因表達(dá)序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)

VelculescuVE等(1995)率先提出的一種分析基因表達(dá)的新策略，其主要特點(diǎn)是能在短期內(nèi)采用PCR或手動測序等通用儀器得到大量的表達(dá)信息，并能對不同狀態(tài)下的表達(dá)基因進(jìn)行定量和定性的檢測，比較完整地直接讀出基因表達(dá)的信息。因此，SAGE技術(shù)在研究表達(dá)基因測序上有較大的發(fā)展?jié)摿?。與cDNA選擇法相比，基因序列表達(dá)分析能減少大量的重復(fù)測序，大大節(jié)省研究時間和費(fèi)用。2023/2/2142/1592023/2/26、動物基因組印跡雜交

動物基因組印跡雜交(Zooblot)是基于人類及其他動物在長期進(jìn)化中普遍存在基因的同源和保守序列的理論設(shè)計的。該方法采用同一基因單拷貝的分子探針與各種動物的基因組DNA作Southern印跡雜交篩選，如果雜交表現(xiàn)為陽性，表明所用的探針中可能包含進(jìn)化過程中的保守序列，即序列間有很高的同源性，該序列可能是外顯子或編碼表達(dá)基因區(qū)域，進(jìn)而分離基因組中的表達(dá)序列。鑒定整個基因→分離相應(yīng)cDNA\mRNA→鑒定蛋白。2023/2/2143/1592023/2/2Zoo-Blotting，

基因組雜交，cDNA雜交，蛋白質(zhì)分析2023/2/2144/1592023/2/27、基因差異表達(dá)

生物體在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下、不同類型細(xì)胞或組織中的結(jié)構(gòu)與功能的變化的差異歸根結(jié)底是基因在時間與空間上的選擇性表達(dá)差異，即為基因的差異表達(dá)。

基因差異表達(dá)的研究策略主要建立在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控過程中，即mRNA差異或cDNA差異和蛋白質(zhì)差異水平，研究較多的是mRNA或cDNA水平。2023/2/2145/1592023/2/2三、疾病基因克隆實例一）FⅧ基因的克?。üδ芸寺unctionalcloning）※基因產(chǎn)物能純化的情況下，通過基因產(chǎn)物的功能分析進(jìn)行基因克隆方法，F(xiàn)Ⅷ基因克隆是功能克隆的典型?！?/p>

蛋白產(chǎn)物精提后經(jīng)胰蛋白酶等消化分解成多肽，把多肽的氨基酸測序后，合