實(shí)驗(yàn)三SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)三SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)步驟本節(jié)課的內(nèi)容第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理電泳的基本知識(shí)和原理SDS的性質(zhì)與作用聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日什么是電泳？

電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場中的泳動(dòng)。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都含有可電離基團(tuán)，在非等電點(diǎn)條件下帶有電荷，在電場力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用樣品中各種分子帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、純化和鑒定的一種綜合技術(shù)?？捎糜跇悠返闹苽?、純度鑒定、分子量測定等。電泳的基本知識(shí)和原理第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日影響帶電粒子在電場中泳動(dòng)的因素1．生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳產(chǎn)生明顯影響。2．緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質(zhì).溶液pH值距離等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時(shí)速度就越快。當(dāng)緩沖液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；當(dāng)緩沖液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶正電荷，電泳時(shí)向負(fù)極移動(dòng)。電泳的基本知識(shí)和原理第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日3．電場強(qiáng)度：

電場強(qiáng)度指每單位介質(zhì)長度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但隨著電場強(qiáng)度的增大會(huì)引起通過介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，從而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增多，最終導(dǎo)致介質(zhì)溫度升高。降低電流強(qiáng)度，可以減少產(chǎn)熱，但會(huì)延長電泳時(shí)間，引起生物大分子擴(kuò)散增加，同樣影響分離效果。所以電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪?qiáng)度。電泳的基本知識(shí)和原理第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日4．電滲：

液體在電場中對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。由于支持介質(zhì)表面存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團(tuán)電離后使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場作用下向電極方向移動(dòng)，形成介質(zhì)表面溶液的流動(dòng)。當(dāng)電滲方向與電泳方向相同時(shí)則加快電泳速度；當(dāng)電滲方向與電泳方向相反時(shí)，則降低電泳速度。電泳的基本知識(shí)和原理第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日5．支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔大小對(duì)生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，反之則泳動(dòng)速度慢。電泳的基本知識(shí)和原理第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日電泳技術(shù)的分類1.根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：①自由電泳不使用支持介質(zhì)，電泳在溶液中進(jìn)行。②區(qū)帶電泳需使用支持介質(zhì)，根據(jù)支持介質(zhì)不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤狀電泳、毛細(xì)管電脈等。2.根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：①高壓電泳使用的電壓在500～1000V，這類電泳分離速度快，但熱效應(yīng)較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。②常壓電泳使用的電壓在500V以下，電位梯度為2～10V/cm。這類電泳的分離速度較慢，但對(duì)電泳設(shè)備要求簡單。電泳的基本知識(shí)和原理第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日3．根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為連續(xù)pＨ電泳和不連續(xù)pＨ電泳：①連續(xù)pH電泳是指電泳全過程中pH保持不變，②不連續(xù)pH電泳是指電極緩沖液和電泳支持介質(zhì)中的pH不同，甚至電泳支持介質(zhì)不同區(qū)段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝膠電泳。4．根據(jù)工作目的和分離樣品的數(shù)量多少分為分析電泳和制備電泳。5．根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)種類不同分為免疫電泳、層析電泳、等電聚焦電泳、轉(zhuǎn)移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場凝膠電泳和相互垂直交替電場凝膠電泳等。6．根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為細(xì)胞電泳、核酸電泳、蛋白質(zhì)電泳等

電泳的基本知識(shí)和原理第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日電泳示蹤劑電泳常用的示蹤劑有溴酚蘭和二甲苯青FF。示蹤劑一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以確保樣品均勻沉入加樣孔內(nèi)。電泳的基本知識(shí)和原理第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日十二烷基磺酸鈉(SDS)

Sodiumdodecylsulphate

CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+

SDS的性質(zhì)與作用SDS是一種陰離子型去污劑，SDS能使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)變性0.1-1%SDS0.1Mbeta-巰基乙醇蛋白質(zhì)變與SDS分子按比例結(jié)合1：1.4SDSSDS的性質(zhì)與作用SDS的結(jié)構(gòu)決定了它可破壞蛋白質(zhì)的疏水作用（該作用對(duì)維持蛋白三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)相當(dāng)重要），SDS：十二烷基磺酸鈉，十二烷基部分是疏水結(jié)構(gòu)，而磺酸鈉部分是親水或極性結(jié)構(gòu)。SDS的疏水結(jié)構(gòu)可插入蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部（通常水溶性的蛋白質(zhì)，其疏水氨基酸殘基埋藏在蛋白內(nèi)部，親水氨基酸殘基位于分子表面），這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，引起變性。beta-巰基乙醇第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系

SDS的性質(zhì)與作用第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品量?。?～100μg）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠?？捎糜诘鞍踪|(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析；還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以測定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：通常采用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無色基，后者再被氧化成自由基而引發(fā)聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時(shí)間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定?；瘜W(xué)聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復(fù)性好。故一般采用化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。濃縮效應(yīng)在濃縮膠中進(jìn)行；電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在分離膠中進(jìn)行。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)步驟一、安裝垂直板型電泳裝置二、凝膠的制備

第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日分離膠的制備在一個(gè)干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。

SDS-不連續(xù)系統(tǒng)12％分離膠濃度，10ml體積配制量：1.30%凝膠貯液4.0ml2.分離膠緩沖液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%過硫酸胺0.06ml6.2%TEMED0.6ml第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日加入分離膠溶液pH8.8封水或飽和乙醇溶液出現(xiàn)明顯界面時(shí)，分離膠凝聚完成（３０min~１h）倒出水或乙醇，并用濾紙吸干制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日濃縮膠的制備在另一個(gè)干凈的小燒杯中。

4.5％分離膠濃度，5ml體積配制用量表：1.30%凝膠貯液0.75mL2.濃縮膠緩沖液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%過硫酸胺0.03mL2%TEMED

0.3mL第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日濃縮膠對(duì)蛋白樣品具有壓縮堆積作用。凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。濃縮膠的工作原理：第二十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日牛血清白蛋白樣品2樣品1蛋白marker樣品1樣品2牛血清白蛋白兩塊膠一個(gè)電泳系統(tǒng)，兩組共用：第一組加樣第二組加樣第二塊膠加樣順序與第一塊膠相同第二十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日三加樣

將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個(gè)樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為10～15μL。如樣品較稀，可加20～30μL。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。第二十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日四電泳

將上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電源，開始時(shí)將電流控制在15～20mA,待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30～50mA。待藍(lán)色染料遷移至下端約1～1.5cm時(shí)，停止電泳，約需1～2小時(shí)。恒壓(60V90V)

第二十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日1.加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.83.通電分離膠pH8.82加入樣品上樣及電泳開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。第二十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日五剝膠

取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)。第三十頁，共三十五頁，2022年，8月28日六染色和脫色

染色用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。加入染色液，染色45分鐘。脫色

染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20～30min換一次脫色液，2～3次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過夜，直至背景清晰。第三十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日七、Mr的計(jì)算

標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。

以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。

第三十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日八轉(zhuǎn)膜膠放在3張緩沖液浸濕的濾紙上