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實(shí)驗(yàn)三血清球蛋白的分離純化及鑒定七年制第一頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2.掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用3.了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路第二頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日
【實(shí)驗(yàn)方法】
一、鹽析法粗分γ-球蛋白二、凝膠過(guò)濾方法脫鹽三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度
第三頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日【基本原理】
蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及在一定條件下,帶電的情況等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別,可分離純化各種蛋白質(zhì)。第四頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾(分子篩)親和層析在分離純化時(shí),根據(jù)情況選用幾種方法,相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。第五頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日【基本原理】
本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過(guò)濾、離子交換層析方法,分離純化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度。
第六頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日實(shí)驗(yàn)思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定先粗后細(xì)離子交換層析純化第七頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日一、鹽析法粗分離血清γ-球蛋白
鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度不同,分別析出,達(dá)到彼此分離的方法。本實(shí)驗(yàn)在半飽和硫酸銨溶液中,清蛋白溶解,球蛋白將沉淀析出,經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。第八頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日定義:加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:
破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素:
水化膜和電荷層中性鹽:(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn):蛋白質(zhì)不變性,常用。鹽析法第九頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日鹽析步驟取離心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO44ml上清液(主要含清蛋白)傾去靜置10min,再離心(5000轉(zhuǎn)/分)10min沉淀用1ml0.9%氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO42ml,搖勻靜置10min,再離心(5000轉(zhuǎn)/分)10min傾棄上清液(主要含α、β球蛋白)沉淀即為初步純化的γ-球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液(pH=6.3)1ml溶解γ-球蛋白粗提液第十頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽
欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽,通常有兩種方法:
凝膠層析法、透析本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨,以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。第十一頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日凝膠層析原理:P31
凝膠層析法是按混合物各組分分子量大小不同隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。
凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒,當(dāng)吸收一定量溶液后溶漲成柔軟、富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)相互作用的惰性物質(zhì),凝膠層析以其為固定相。層析時(shí),直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部,只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng),所以流程短、流速快,首先流出層析柱;而小分子物質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入,洗脫時(shí)間長(zhǎng),后流出層析柱,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間層析,分子大小不同的物質(zhì)彼此分開(kāi),達(dá)到分離的目的。
第十二頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日凝膠層析法脫鹽第十三頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日凝膠柱層析脫鹽第十四頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日分子篩層析第十五頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日數(shù)學(xué)模型VoViVtVi—凝膠孔內(nèi)水(內(nèi)水)Vo—顆粒間水(外水)Vg—凝膠體積總體積Vt=Vi+Vo+Vg第十六頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日Kd—分配系數(shù):精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為,反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度,是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve—洗脫體積:分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積Kd=(Ve-Vo)/Vi
洗脫曲線:以洗脫體積為橫坐標(biāo),各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖第十七頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日(1)完全被排阻的極端大分子,Ve=Vo,Kd=0(2)中等分子,Ve=Vo+Kd·Vi,0<Kd<1(3)完全滲透的小分子,Ve=Vo+Vi,Kd=1第十八頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日▲SephadexG-25的準(zhǔn)備▲裝柱(15~20cm)操作步驟:1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水,排出空氣,關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液,調(diào)節(jié)流速10滴/min,使凝膠均勻沉降,不斷補(bǔ)充,直至18cm。4、上留1-2mm的水,關(guān)閉出口。
注意:★床面上要保持少許水,防止膠床露出液面。
★膠面不平,用玻棒輕輕攪動(dòng),讓凝膠自然沉降,使表面平整。第十九頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日▲加樣與洗脫▲凝膠的再生1、加樣:用滴管將鹽析后樣品加入柱床面,打開(kāi)出口使樣品溶液滲入凝膠。2、洗脫:加入洗脫液,打開(kāi)出口,保持流速10滴/min,收集洗脫液,每管收集1ml。用奈氏試劑檢測(cè)NH4+。3、保存:20%璜基水楊酸溶液檢測(cè)洗脫液的蛋白質(zhì),保存含量高的進(jìn)一步純化
不斷加洗脫液,使NH4+全部流出,為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備第二十頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日脫鹽
12345678910②上樣γ-球蛋白,粗提液①裝柱葡聚糖凝膠G-25,柱高18-20cm流速:每分鐘10滴左右
③加入洗脫劑④收集20滴換一支試管第二十一頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日⑤.層析后洗脫液檢測(cè)白色比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑(檢測(cè)NH4+),另一塊滴加20%璜基水楊酸(檢測(cè)蛋白質(zhì))。不用滴管,避免污染,直接倒…用“-”表示無(wú)現(xiàn)象,用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺⑥回收凝膠第二十二頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日注意事項(xiàng):
1.凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞。
2.加樣分離時(shí),滴速越慢,分離效果越好?!?/p>
以管號(hào)為橫軸,蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二十三頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日三、DEAE-纖維素離子交換層析
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1.通過(guò)使用DEAE-纖維素離子交換層析法,進(jìn)一步純化γ-球蛋白脫鹽液,得到較純的γ-球蛋白溶液
2.學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用第二十四頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日離子交換層析的基本原理
離子交換層析是一種常用的、通過(guò)使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì),在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電,則能結(jié)合陽(yáng)離子,成為陽(yáng)離子交換劑;如果其帶正電,則能結(jié)合陰離子,稱為陰離子交換劑??筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要,選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。
DEAE(二乙基氨基乙基)-纖維素含有可離子化的堿基,可與氫離子結(jié)合,成為帶正電荷的陰離子交換劑。第二十五頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日DEAE-纖維素離子交換層析純化γ-球蛋白血清α、β、γ-球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為:清蛋白pI=4.64,
α2球蛋白
pI=5.06,
β球蛋白pI=5.12,
γ球蛋白pI=7.3本實(shí)驗(yàn)采用0.0175mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液進(jìn)行洗脫。此pH,DEAE帶正電荷,可與帶負(fù)電荷的α、β-球蛋白和清蛋白結(jié)合,而帶正電荷的γ-球蛋白不與DEAE結(jié)合,首先從層析柱中洗脫出來(lái),首先收集到的既是純化的γ-球蛋白。第二十六頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日操作將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上(方法同凝膠過(guò)濾),用0.0175mol/lpH6.3NH4Ac緩沖液洗脫,流速10滴~15滴/分,用小試管連續(xù)收集流出液(約1.0ml/管),用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況,收集含量最高的部分,濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來(lái)的是γ-球蛋白。第二十七頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日1.使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。2.裝柱時(shí)檢查是否漏水。3.裝柱后凝膠均一無(wú)斷層,無(wú)氣泡,柱床面平整。4.柱床面保持有緩沖液。5.加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔,不要破壞柱床面的平整。6.每用一次滴管,請(qǐng)用水清洗干凈,防止試劑及被測(cè)樣品交叉污染。第二十八頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日四、γ-球蛋白純化液的濃縮
利用葡聚糖凝膠富含羥基,吸水,不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性,在樣品溶液中加少量凝膠,離心,濃縮蛋白。
每ml純化γ-球蛋白溶液加SephadexG-250.25g,搖動(dòng)2~3分鐘,離心3000r/min,5分鐘,上清即為濃縮γ-球蛋白(或用冷凍干燥儀使其濃縮)。
第二十九頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日五、γ-球蛋白鑒定
用醋酸纖維素薄膜電泳的方法,以血清電泳圖譜為對(duì)照,鑒定所分離的蛋白質(zhì)種類和純度(參見(jiàn)血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳)。
第三十頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日蛋白質(zhì)的電離示意圖
第三十一頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日基本原理1、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2、在pH8.6巴比妥緩沖液中,血清蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中均帶負(fù)電荷,向正極移動(dòng)。3、帶電荷多、分子量相對(duì)小的泳動(dòng)速度快;帶電荷少、分子量相對(duì)大的泳動(dòng)速度慢。第三十二頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日血清蛋白質(zhì)乙酸纖維素薄膜電泳第三十三頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日清蛋白12
加樣線加樣線純化蛋白對(duì)照樣品第三十四頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日醋酸纖維素薄膜電泳鑒定
點(diǎn)樣:全血清:點(diǎn)樣一次脫鹽后的粗蛋白溶液:點(diǎn)樣3~5次濃縮后的純?chǔ)茫虻鞍兹芤海狐c(diǎn)樣3~5次第三十五頁(yè),共三十七頁(yè),2022年,8月28日醋酸纖維素薄膜電泳電泳條件:
電壓:90-110V;時(shí)間:50分鐘。染色:電泳畢,關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分鐘,用2.5%醋酸洗脫
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