實(shí)驗(yàn)體外重組

實(shí)驗(yàn)體外重組第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握體外DNA的重組過程；學(xué)習(xí)外源DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后與載體的連接及轉(zhuǎn)化過程；學(xué)習(xí)對(duì)DNA重組子的篩選方法。第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)步驟預(yù)期結(jié)果注意事項(xiàng)第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)原理1、DNA重組簡介2、DNA連接酶3、TA克隆4、藍(lán)白篩選第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日DNA重組是外源DNA與載體分子的連接，重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2＋、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將經(jīng)過酶切的或脫磷酸處理的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。這樣經(jīng)過重新組合的DNA叫做重組體或重組子。1、DNA重組簡介第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日DNA重組包括如下步驟：外源DNA片段的制備；載體的選擇；DNA片段與載體連接；導(dǎo)入宿主細(xì)胞。第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日2種連接酶——T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。（1）大腸桿菌DNA連接酶僅能連接具有相同粘性末端的兩個(gè)DNA分子。2、DNA連接酶第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日（2）T4噬菌體DNA連接酶不僅能連接具有相同粘性末端的兩個(gè)DNA分子，還可以連接平末端雙鏈DNA分子。

但后者連接效率比較低，一般可提高T酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日2、DNA連接酶

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4連接酶與輔助因子AMP形成酶-AMP復(fù)合物；然后，酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’-磷酸基和3’-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。酶最適溫度為37℃，但該溫度下粘性末端氫鍵不穩(wěn)定，所以連接反應(yīng)一般采取12~16℃連接過夜。第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日3、TA克隆將3′端具有單個(gè)“A”突出末端的PCR產(chǎn)物克隆到3′端具有單個(gè)“T”突出末端的線性化載體的克隆法。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日4、藍(lán)白篩選pUC質(zhì)粒載體含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacz）的啟動(dòng)子（受IPTG誘導(dǎo)）及其編碼α肽鏈（β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特稱為lacz’基因）。位于lacz’基因中靠近5’端有一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日受體大腸桿菌細(xì)胞的β-半乳糖苷酶發(fā)生了突變，失去的氨基末端。當(dāng)lacz’基因編碼的α肽鏈同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG誘導(dǎo)下，會(huì)啟動(dòng)表達(dá)，分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色背景。第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日當(dāng)MCS中插入外源基因后，會(huì)阻斷α肽鏈合成，不能形成互補(bǔ)，不能產(chǎn)生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色背景。所以含有重組質(zhì)粒載體的克隆是白色的。第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)材料l、儀器和材料感受態(tài)細(xì)胞(如E.coliJMl09、DH5a)恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，恒溫水浴槽，1.5mL微量離心管（Ep管），微量取液器200μL及20μL吸頭，電泳儀，電泳槽。第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日

2、試劑

(1)載體：質(zhì)粒pUCl8/19(2)目的基因：如小牛胸腺DNA(3)限制性內(nèi)切酶：EcoRI，HindⅢ(4)T4DNA連接酶

(5)0.1mol/LCaCl2溶液

(6)LB瓊脂固體平板（含氨芐青霉素）

(7)5mLLB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）

(8)20mg/mLX-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）

(9)200mg/mLIPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）

(10)瓊脂糖

(11)無菌雙蒸水第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)步驟1、雙酶切目的基因及載體（TA克隆法可省此步）2、連接與轉(zhuǎn)化3、培養(yǎng)觀察第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日1、連接（5μL體系）：pEASYT31μLPCR純化產(chǎn)物1-4μL（Taq酶擴(kuò)增）25℃連接15min。一般，載體:外源基因（摩爾比）=1:2~1:102、轉(zhuǎn)化：10μL連接產(chǎn)物全用來轉(zhuǎn)化200μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在含Amp的LB平板上，添加40μL20mg/mLX-gal及4μL200mg/mLIPTG，然后涂布轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。3、培養(yǎng)：37℃，倒置培養(yǎng)16h后，觀察結(jié)果。計(jì)數(shù)白色和藍(lán)色