實驗室細胞培養(yǎng)基本知識

實驗室細胞培養(yǎng)基本知識第一頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)基本概念細胞培養(yǎng)：從動物或植物中取出細胞，使其在合適的人工環(huán)境中生長。細胞來源：細胞可直接從組織中取出并采用酶或機械方法進行解離，也可來自已經建立的細胞系或細胞株。原代培養(yǎng)：是指將細胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖，直到占據(jù)所有可用基質(即：匯合)的培養(yǎng)階段。傳代培養(yǎng)：在細胞生長至匯合，必須將細胞轉移到新的容器中并更換新鮮培養(yǎng)基，為其提供更多繼續(xù)生長的空間。細胞系：首次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細胞系。細胞株：如果將細胞系的一個細胞通過克隆或者其他方法從培養(yǎng)物中明確地選擇出來，就成為一個細胞株。第二頁，共六十八頁，2022年，8月28日有限細胞系與連續(xù)細胞系：正常細胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會喪失增殖的能力，這是一個由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種只能分裂有限的次數(shù)的細胞系被稱為有限細胞系。但是，一些細胞系會通過“轉化”的過程變?yōu)橛郎约毎?，這一過程可自然發(fā)生，也可經化學或病毒誘導發(fā)生。有限細胞系發(fā)生轉化獲得無限分裂能力后，就成為連續(xù)細胞系。培養(yǎng)條件：細胞培養(yǎng)的人工環(huán)境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質或介質，為細胞提供必需的營養(yǎng)素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質)、生長因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調節(jié)其物理化學環(huán)境(pH、滲透壓、溫度)。細胞培養(yǎng)基本概念第三頁，共六十八頁，2022年，8月28日為什么要細胞培養(yǎng)？避開機體自身調節(jié)和實驗應激的整體因素的影響；環(huán)境控制、均一性（可以使用一批同源細胞獲得穩(wěn)定、可重復的結果）、經濟、規(guī)模和機械化；第四頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)的應用細胞培養(yǎng)是細胞和分子生物學中最重要的一項技術，可為細胞正常生理和生化(例如：代謝研究、衰老研究)、藥物和毒性化合物對細胞的作用以及致突變和致癌研究提供上佳的模型系統(tǒng)。細胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)以及生物化合物(例如：疫苗、治療性蛋白)的大規(guī)模生產。第五頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)實驗室一更二更一間二間三間走廊隔間準備室第六頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)設備基本設備：細胞培養(yǎng)通風櫥(即：層流通風櫥或生物安全柜)培養(yǎng)箱(推薦使用濕式二氧化碳培養(yǎng)箱)水浴鍋離心機冰箱和冰柜(–20°C)細胞計數(shù)器(例如：Countess?自動細胞計數(shù)器或血球計數(shù)器)倒置顯微鏡液氮(N2)冷凍柜或凍存容器滅菌器(即：高壓滅菌器)擴增設備：抽吸泵(蠕動泵或真空泵)pH計共聚焦顯微鏡流式細胞儀其他用品：細胞培養(yǎng)容器(例如：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)吸管和移液器注射器和針頭廢物容器培養(yǎng)基、血清和試劑細胞系第七頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)通風櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空氣流動，保護工作環(huán)境免受灰塵及其他空氣污染物污染。氣流可以呈水平方向，與工作臺面平行吹過，或者也可呈垂直方向，從通風櫥上方吹向工作臺面。第八頁，共六十八頁，2022年，8月28日第九頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日準備與滅菌第十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：160℃，1h；熱穩(wěn)定的液體：水、鹽溶液和適度熱穩(wěn)定的塑料制品：硅樹脂、尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯用濕熱滅菌：121℃，20min；不耐熱液體：過濾除菌；不耐熱物品：射線滅菌30min，70%乙醇擦拭。第十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日滅菌方式的選擇項目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃品高壓滅菌，將蓋懸松玻璃移液管干熱槍頭高壓滅菌離心管(5ml，15ml，50ml)高壓滅菌，直立放置EP管(1.5ml，2ml，5ml，10ml)高壓滅菌試管干熱艾本德移液器（新）高壓滅菌，整支高壓滅菌過濾瓊脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油膠原酶HEPES藥物甲基纖維素谷氨酸鹽酚紅生長因子鹽溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸鈉胰蛋白酶第十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中，侵泡過夜或至少2h（鋁、銅制品不得浸泡）;試管刷清洗，自來水沖洗4次，去離子水沖洗3次；倒置于烘箱中烘干；鋁箔封口保存；使用前24~48h，放入干熱滅菌箱中，160℃滅菌1h，自然冷卻后使用；100目和600目的篩網需要超聲清洗。第二十頁，共六十八頁，2022年，8月28日塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中浸泡30min，自來水沖洗干凈；置于超聲清洗器中清洗30min；用自來水充分清洗后用去離子水清洗（塑料制品要用專用的刷子或者將自來水連上膠管伸進塑料管內部沖洗）；將離心管的蓋子和管體分開用圖紙包起來，直立放入滅菌鍋中濕熱滅菌121℃，20min（高速離心管尤其注意滅菌時要直立放置）；自然冷卻后置于烘箱中烘干。第二十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日水的制備和滅菌細胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；第一：反向滲透或蒸餾；第二：碳過濾去除有機或無機膠體（總有機碳TOC≤10ug/L）；第三：去離子（電阻≥10MΩ/cm）；高壓滅菌121℃，20min，自然冷卻。第二十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；放在磁力攪拌器上，設定轉速200r/min；打開PBS干粉（1L裝）加入燒杯中；攪拌至完全溶解；PH計檢測PH為7.4，變化＜0.1；分裝至滅菌的儲液瓶中，蓋子只輕旋一圈，放入滅菌鍋中濕熱滅菌；自然冷卻后蓋緊，4℃或室溫保存。第二十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設定200r/min，邊攪拌邊加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）；用注射器吸取超純水，將包裝袋內殘留培養(yǎng)基洗下；干粉溶解后加入2.438gNaHCO3，攪拌至完全溶解；用HCl和NaOH調節(jié)PH為7.2，過濾除菌后（PH接近7.4）4℃保存；商業(yè)胎牛血清一般是熱滅活的，可以直接使用，如果需要過濾，先用0.22μm濾器過濾后，再用0.1μm濾器低壓過濾才能保證無菌、無支原體。雙抗：稱取氨芐青霉素0.625g，鏈霉素1g，PBS定容至100ml，4℃過夜，過濾除菌分裝。使用時如需配置200ml完全培養(yǎng)基，需加入180mlDMEM/F12，加入20ml胎牛血清，再加入2ml雙抗即可。使用時再加入血清的好處是DMEM/F12培養(yǎng)基可以4℃保存6~9個月，而加入血清后只能保存2~3周。第二十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術第二十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立一個屏障，防止微生物的污染，細菌、支原體、酵母菌、真菌孢子等。要求：與培養(yǎng)物直接接觸的所有材料必須無菌（物品無菌），培養(yǎng)物和它的非滅菌環(huán)境之間不能有直接接觸（環(huán)境無菌）。要素：無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。第二十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日無菌工作區(qū)域——潔凈臺的使用在一個十分干凈的工作臺上開始工作（什么都沒有）；用70%乙醇充分擦洗、紫外滅菌30min；只把需要的物品（確保充分滅菌或用70%酒精擦拭）放入工作臺內，潔凈臺不可用做儲存區(qū)域；將工作區(qū)的物品整理好（中央寬敞、容易拿取、拿取時不跨越物品、不遮擋層流）；隨時移走不再需要的物品；要在視野范圍內操作；如有任何溢出物需隨時擦去，并用70%乙醇擦洗；實驗完畢要移走潔凈臺里的所有物品（什么都沒有），并用70%乙醇徹底擦洗工作面，然后紫外滅菌30min；第二十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日在通風櫥中部開闊區(qū)域放置細胞培養(yǎng)容器移液器置于右前方易于取用的地方試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取試管架置于中后部，用于固定其他試劑小型容器置于左后部，用于盛放廢液第二十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日第二十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日良好的個人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；更換潔凈服（長款）；女生要將頭發(fā)扎在身后；戴上乳膠手套；操作中經常進行手消毒（自動手消毒機）；如進行有生物危險的實驗時，需要P2實驗室、生物安全柜、保證無裸露的皮膚。第三十頁，共六十八頁，2022年，8月28日外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經過嚴格的質量控制以確保其無菌性，但其瓶子的外表面不是無菌的，新采購的試劑瓶子以及從冰箱或水浴槽中拿出來后，要用70%酒精擦拭滅菌再放入潔凈臺內。自己配置的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液必須采用適當?shù)臏缇椒?例如：高壓蒸汽、無菌過濾)進行滅菌。引進的培養(yǎng)物（如購買的細胞系）是高危污染源，要先經過檢疫，并堅持用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)直至證明沒有污染。第三十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應每學期做徹底清潔（箱體、架子、隔板、托盤），可用70%酒精充分擦拭，并完全揮發(fā)晾干。培養(yǎng)箱使用時底部濕盤要加入1%硫酸銅。培養(yǎng)細胞時，盡可能選購帶滲透蓋的培養(yǎng)瓶，不僅可以在CO2環(huán)境中迅速達到平衡，而且不會有污染的危險。第三十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺使用前、使用中的間隙、使用后都要用紫外滅菌，但光束的有效性有限，因為它不能達到縫隙中。70%酒精擦拭：潔凈臺使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各種試劑瓶、儲液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿，放入潔凈臺之前，必須用70%乙醇擦拭其外部，注意要選用抗乙醇的記號筆。移液：使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用時方可打開無菌吸管的包裝。吸管應始終位于工作區(qū)域內。一般移液操作用移液管和電動移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次為多個器皿分裝液體用注射器，只有滅菌的部分（移液管、槍頭、注射器）可以伸進無菌容器內（儲液瓶、細胞培養(yǎng)瓶），移液時避免使吸管尖端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣。第三十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子，使用時要將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域，不用時要及時蓋好，但可以不用旋緊。灼燒：開放工作臺才需要灼燒，細胞培養(yǎng)用的潔凈臺中不需要也不建議灼燒、明火既破壞了層流又難以除去生物危害物質，還帶來了火災隱患，明火帶來的高溫還會影響HEPA過濾的壽命。試劑瓶和培養(yǎng)瓶的操作：在潔凈臺內可以使試劑瓶口敞開直立，但不能讓手或其他物品在開口的容器或無菌吸管的上方往來。倒出液體：任何時候都不要從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中直接傾倒培養(yǎng)基和試劑。第三十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日小結保持一個干凈有調理的工作空間，并僅在需要的時候才在其中工作。盡可能的預先準備好再開始操作，使培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱外停留最短的時間，而且要做到各種操作快速、簡便和順利。保持能看到操作面上的每樣東西，時時警惕無菌面和非無菌面的偶然接觸。實驗完畢后，保持工作區(qū)的干凈整潔。第三十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日污染化學污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑；生物污染：細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。細菌：通常被細菌污染的培養(yǎng)物呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時表面會覆蓋一層薄膜。另外，經常還會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細菌為細胞之間移動的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個細菌的形狀，有球狀、桿狀和螺旋狀等。圖為被大腸桿菌污染的293細胞第三十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會變得渾濁，

但pH值變化極小，污染嚴重時pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒，有些會芽生出較小的顆粒。圖為293細胞被酵母污染。霉菌：是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細胞絲狀體形式生長。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細束狀纖維，有時呈較為密集的孢子團塊。病毒：是一種微觀感染性物質，利用宿主細胞結構進行復制。病毒體積極小，因而要檢測培養(yǎng)物中有無病毒以及將其從細胞培養(yǎng)實驗室所用試劑中去除都十分困難。使用病毒感染的細胞培養(yǎng)物時卻會對實驗室工作人員造成嚴重的健康威脅，特別是當實驗室培養(yǎng)的是人或靈長類動物細胞時。第三十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日支原體：是一種沒有細胞壁的簡單細菌，被認為是能夠自我復制的最小的生物。由于體積極小(一般小于1微米)，支原體的檢測十分困難?？稍谂囵B(yǎng)物中持續(xù)存在造成慢性支原體感染，而不會導致細胞死亡，表現(xiàn)為：細胞增殖速度降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；MycoFluor支原體檢測試劑盒：A固定細胞無污染，B固定細胞支原體污染，C活細胞支原體污染。第三十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日抗生素的使用細胞培養(yǎng)時不應常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發(fā)生交叉反應，干擾您研究的細胞過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。第三十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)基本知識—獲取細胞您可以通過原代細胞建立自己的培養(yǎng)系，或者也可選擇從商業(yè)供應商或者非盈利性供應單位(即細胞庫)處購買已經建立的細胞系。聲譽良好的供應單位可提供優(yōu)質的細胞系，而且會認真地對細胞系進行檢測，以確保其完好性，并且未被污染。不建議從其他實驗室借用細胞，因為這會帶來很高的污染風險。無論來源如何，使用細胞之前都應確保所有新到細胞系已經過支原體污染檢測。第四十頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)環(huán)境物理化學環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO2；生理環(huán)境：激素和營養(yǎng)素濃度；培養(yǎng)方式：一種是使細胞在人工基質上單層生長(即：貼壁培養(yǎng))，另一種是使細胞在培養(yǎng)基中自由漂浮生長(懸浮培養(yǎng))。除造血細胞系和其他一些細胞外，大多數(shù)脊椎動物細胞均具有貼壁依賴性，必須在合適的基質上培養(yǎng)，且該基質必須經過特殊處理，以便細胞粘附和伸展。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的成分，因為它可提供細胞生長所必需的營養(yǎng)素、生長因子和激素，并能調節(jié)培養(yǎng)體系的pH值和滲透壓。培養(yǎng)基可分為三類：基礎培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，三者對血清添加量的要求不同。第四十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日血清：是基礎培養(yǎng)基中極為重要的細胞生長和粘附因子、激素、脂質和礦物質來源。此外，血清還可調節(jié)細胞膜通透性，并可作為向細胞內運送脂質、酶、微量營養(yǎng)素和微量元素的載體。但是，在培養(yǎng)基中添加血清也有一些缺點，包括：成本高，存在標準化、特異性和變異性問題，具有一些不良效應，如：可促進或抑制某些細胞的生長或功能。pH值：大多數(shù)正常的哺乳動物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細胞株間差異極小。但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境(pH7.0–7.4)中生長較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境(pH7.4–7.7)?？赏ㄟ^添加有機緩沖鹽(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽來緩沖細胞培養(yǎng)中的pH值變化。二氧化碳：通常使用濃度為5%的二氧化碳來控制培養(yǎng)體系的pH值，大多數(shù)細胞二氧化碳濃度在4–10%之間。溫度：大多數(shù)人和哺乳動物細胞系在36℃至37℃下具有最佳生長狀態(tài)。禽類細胞系在38.5°C時具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細胞也可在37°C下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。第四十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日補充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關到最小和開到最大均不會漏氣，只有開到中間大小才會漏氣；CO2氣壓過大吹壞培養(yǎng)箱濾器問題；上海減壓閥門廠樊瑞YT12X-0.1L￥380第四十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確認細胞健康狀態(tài)，還要仔細觀察培養(yǎng)的細胞以確定無污染；細胞變質的征象包括：核周顆粒、胞質空泡、細胞隆起變圓或與基質分離等，這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。變質嚴重時將會成為不可逆的變化（啟動了細胞凋亡），因此換液和傳代的頻率要避免發(fā)生這些變化，因為這些變化很難逆轉；新加入工作的培養(yǎng)員要先看一下細胞系留存的細胞參考圖片（以不同密度下拍攝），并且在以后的培養(yǎng)中經常比較，及時發(fā)現(xiàn)問題。第四十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細胞分為三大類。成纖維樣細胞：為雙極或多極細胞，呈細長形，貼附在基質上生長。上皮樣細胞：呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質上呈散在斑片狀生長。淋巴母細胞樣細胞：呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質表面。神經元細胞：有多種形狀和大小，I型(有很長的軸突)，II型(沒有軸突)。成纖維樣細胞上皮樣細胞淋巴母細胞樣細胞第四十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細胞也要更換；換液的依據(jù)：1.PH降低，PH降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細胞代謝的副產物，具有細胞毒性，是細胞生長的不利因素。培養(yǎng)基變橙色時需要換液，如果培養(yǎng)基變成黃色，此時PH已達到6.0，細胞將會失去活性；2.細胞的密度和類型，每種細胞都有其適合的接種密度，且生長速度也不相同，有的細胞系甚至需要每天換液和傳代，培養(yǎng)前一定要了解清楚；3.形態(tài)發(fā)生衰退，要做到對細胞形態(tài)很熟悉并且定期觀察，細胞形態(tài)衰退不可逆，要避免發(fā)生。第四十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細胞的密度以及是否有污染和衰退，決定是否換液；以70%酒精擦拭培養(yǎng)瓶底；打開培養(yǎng)瓶蓋，用5ml移液器或蠕動泵吸出培養(yǎng)基；加入預熱的新鮮培養(yǎng)基，如果是不易貼壁的細胞（293），可以將培養(yǎng)瓶立起，將培養(yǎng)基加在細胞培養(yǎng)面的對側，防止將細胞吹散；蓋好蓋子，放回培養(yǎng)箱。第四十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代細胞生長：延遲期、對數(shù)生長期、停滯期；細胞進入對數(shù)生長晚期、接近匯合而未達到匯合狀態(tài)時即應進行傳代。正常細胞達到匯合狀態(tài)時會脫離細胞周期并停止生長，進入停滯期(接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復。轉化細胞即使達到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但如不及時傳代會開始衰退，并且增殖效率逐漸降低，最后逐漸死亡；若細胞處于延滯期不要傳代，脫離細胞周期的細胞需傳代后繼續(xù)培養(yǎng)恢復；傳代要注意接種密度，若到了適合的時間還沒有匯合要增加接種密度，若很快彼此匯合要降低密度。原代前脂肪傳代比率是1:2第四十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代步驟傳代準備：裝有貼壁細胞的培養(yǎng)容器；新的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿；一次性無菌吸管、槍頭等；完全生長培養(yǎng)基，預熱至37℃；磷酸鹽緩沖液（PBS），不含鈣、鎂和酚紅，預熱至37℃；胰蛋白酶，預熱至37℃；細胞計數(shù)器；傳代步驟吸出舊的培養(yǎng)基并丟棄；用PBS沖洗細胞(每10cm2培養(yǎng)表面積需要2mL溶液，25cm2瓶加5mlPBS)。從貼壁細胞層的對側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，輕搖容器；吸出PBS并丟棄；第四十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日傳代步驟加入預熱的胰蛋白酶，試劑量應足以覆蓋細胞層(每10cm2大約0.5mL)，輕輕搖晃容器，使胰蛋白酶完全覆蓋細胞層；將多余的胰酶吸出，將培養(yǎng)容器在37℃下孵育約2~10分鐘，不同細胞系孵育時間有所差異；在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細胞解離；加入預定體積的新鮮培養(yǎng)基。吹打細胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。細胞計數(shù)，將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度；將細胞重進接種到新的細胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱。第五十頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護劑（DMSO、甘油）可使細胞內的水分離開細胞，在極低的溫度下（液氮-196℃）保存細胞，快速復蘇，減少細胞內晶體的形成;DMSO：濃度范圍5%~15%，最佳7.5%~10%;細胞密度較高似乎有利于提高存活率（106~107）；以1℃/min的速度冷凍存活率最高，程序降溫盒；第五十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日凍存步驟鏡檢細胞：外觀健康、形態(tài)學特征、處于平臺期前的對數(shù)生長晚期、沒有污染；用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化后離心，棄去培養(yǎng)基；加入含有10%DMSO的凍存液，使細胞濃度為106~107；將細胞懸液分裝至標記好的凍存管中，擰緊蓋子；將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃過夜；次日，將凍存管轉移至液氮中保存并填寫凍存記錄，一周后從液氮中取出一只驗證凍存效果，再次記錄。第五十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日凍存細胞使用管理新獲得的細胞系應盡快凍存幾只，稱為原始凍存；當細胞系大量繁殖成功應進行凍存，作為種子儲備；應保護好原始凍存和種子儲備，絕不可分發(fā)使用；若使用或分發(fā)該細胞系，需要連續(xù)培養(yǎng)該細胞系并分次凍存，分次凍存可分發(fā)給其他使用者，使用者需要按需自己凍存，當使用者不在需要該細胞系時，應予以丟棄而不可傳給他人使用；當分次凍存將要用盡時，可從種子儲備細胞進行補充，當種子儲備低于5只時，可用原始凍存進行補充，要根據(jù)細胞使用的情況盡可能多的預留分次凍存細胞。第五十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞轉染基本知識第五十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日什么是轉染？為什么要做轉染實驗？細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達與調控、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。

第五十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日轉染技術的分類常規(guī)轉染技術分為兩大類，一類是瞬時轉染(transienttransfection)，一類是穩(wěn)定轉染(stabletransfection)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱永久轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/10000的轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。

第五十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日瞬時轉染轉染方法原理特點磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞操作簡便但重復性差，不適用于原代細胞DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞相對簡便、結果可重復，但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入細胞適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大，需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件陽離子脂質體法（常用）帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染效果隨細胞類型變化較大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放并表達可用于表皮細胞，成纖維細胞，淋巴細胞等第五十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日穩(wěn)定轉染轉染方法原理特點腺病毒法通過侵染宿主細胞將外源基因導入。除了卵細胞以外，不會整合到宿主染色體中；除了抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞，能感染幾乎所有的細胞類型。慢病毒法隨機整合到宿主染色體，可能導致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大。逆轉錄病毒法隨機整合到宿主染色體，可能導致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大，細胞需處于分裂期。第五十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日慢病毒表達系統(tǒng)腺病毒表達系統(tǒng)逆轉錄病毒表達系統(tǒng)病毒基因組RNADNARNA病毒原型人免疫缺陷I型病毒(HIV)

人5型腺病毒(Ad5)白血病病毒(MMLV)

載體系統(tǒng)1個表達質粒和3個包裝質粒1個穿梭質粒和1個輔助質粒1個表達質粒宿主細胞分裂和非分裂的動物細胞分裂和非分裂的動物細胞分裂的動物細胞是否整合整合型非整合型整合型表達豐度高水平表達高水平表達高水平表達表達時間慢(2~4天)快(1~2天)快(1~2天)克隆容量不超過6kb的外源片段高達8kb的外源片段不超過6kb的外源片段免疫原性低高低過表達micro

RNA特別適合適合不適合RNAi特別適合適合適合第五十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日病毒介導的穩(wěn)定細胞株構建感染目的細胞抗生素篩選建立單克隆細胞株擴增單克隆細胞株Westernblot檢測擴大培養(yǎng)2-3株Westernblot檢測第六十頁，共六十八頁，2022年，8月28日影響轉染效率的因素有很多，細胞株本身的特性和活性，細胞培養(yǎng)條件，轉染的DNA或RNA的質量，轉染方法，轉染試劑的選擇等。我們在實驗中最常用的方法是脂質體轉染，利用脂質體轉染法最重要的就是減小脂質體的毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染時間的長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要因素，通過實驗摸索的合適轉染條件對于轉染效率的提高有巨大的作用。

根據(jù)實際情況選擇合適的轉染方法第六十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日影響轉染效率的因素

1、轉染試劑2、細胞狀態(tài)3、細胞密度4、血清5、抗生素6、DNA質量7、載體構建第六十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日轉染試劑不同細胞系轉染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇最適合實驗設計的轉染試劑。當然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉染試劑。需要注意的是脂質體（如Lipo2000）最怕劇烈吹打，更不能震蕩，那樣脂質體會全部失效。

第六十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞狀態(tài)一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。最適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉染。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經歷突變，這會導致和轉染相關的細胞行為發(fā)生變化，也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉染效率降低，可以嘗試轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結果。

第六十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞密度不同的轉染試劑，要求轉染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試