實驗室設(shè)備培養(yǎng)基無菌操作

實驗室設(shè)備培養(yǎng)基無菌操作第一頁，共七十頁，2022年，8月28日AGlimpseofPlantTissueCulture第二頁，共七十頁，2022年，8月28日第一節(jié)基本設(shè)備一、實驗室的組成實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。

第三頁，共七十頁，2022年，8月28日標準組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染第四頁，共七十頁，2022年，8月28日洗滌室藥品室滅菌室貯放室配制室走廊培養(yǎng)室緩沖間接種室第五頁，共七十頁，2022年，8月28日１、洗滌室玻璃器皿和塑料器皿１、洗滌包括用自來水、洗液、洗滌劑清洗２、烘干包括自然晾干和烘箱干燥洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應配備大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運輸培養(yǎng)器皿。備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。第六頁，共七十頁，2022年，8月28日２、藥品室存放常用的化學試劑無機鹽類、有機物、生長調(diào)節(jié)劑等３、制備室培養(yǎng)基的配制生理生化測定４、儲存室（區(qū)）存放配制后的培養(yǎng)基或未用完的培養(yǎng)基５、滅菌室即消毒室，是培養(yǎng)基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒滅菌的地方第七頁，共七十頁，2022年，8月28日６、操作室也稱接種室，用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術(shù)程序要求：干爽安靜，清潔明亮。墻壁光滑平整不易積污灰塵，地面平坦無縫便于清洗和滅菌。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。在適當位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)。

接種室應設(shè)有緩沖間，面積1m2為宜。進入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時帶入雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈。第八頁，共七十頁，2022年，8月28日第九頁，共七十頁，2022年，8月28日７、培養(yǎng)室接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料培養(yǎng)的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約10cm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高1.7m左右。長度根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，

培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般20—27℃左右，室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度在70%～80%為好，控制光照時間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，現(xiàn)代組培實驗室大多設(shè)計為采用天然太陽光照作為主要能源，可節(jié)省能源，且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。第十頁，共七十頁，2022年，8月28日第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日馴化室植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，先移到馴化室進行練苗，待生根成活后，再移到田間苗圃。第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日二、基本設(shè)備１、烘箱洗滌室作用：干燥洗凈的器皿高溫干熱滅菌測定培養(yǎng)物的干重氣浴第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日２、冰箱制備室作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。超低溫冰箱：第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日３、滅菌鍋滅菌室類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種器皿的消毒第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日４、超凈工作臺操作室（接種室）類型：垂直式和水平式作用：無菌操作平臺第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日５、酸度計制備室作用：測定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值酸度計第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日6、顯微鏡觀察室類型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細胞活力觀察解剖顯微鏡立體觀察第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日7、天平制備室作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日8、玻璃器皿需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；透光度好，能耐高壓高溫，能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿。培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等顯微鏡下觀察用的：細胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等最常使用的是三角瓶，規(guī)格有l(wèi)OOml，250ml，500ml等，一般使用100ml三角瓶，無論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長，受光也比試管好。由于瓶口較小，亦不易污染。第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日培養(yǎng)皿：要求上、下能密切吻合。在游離細胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。試管：18mmX180mm或20mmX200mm規(guī)格。可用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不易污染。

培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。廣口的200ml罐頭瓶：加蓋半透明的塑料蓋，瓶口大，大量繁殖時操作方便、工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。缺點：易引起污染。

瓶口封塞：一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。棉塞封口：夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基的濕度?，F(xiàn)多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可提高培養(yǎng)空間利用率的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來，從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，耐高溫，可進行高壓滅菌。有些器皿為一次性消耗品，可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時比較方便。第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日9、接種用具1．鑷子類(forceps)

根據(jù)操作需要有各種類型，鑷子過短．容易使手接觸瓶口，造成污染。鑷子太長，使用起來不靈活。如在分離莖尖幼葉時，用更小的鐘表鑷子。2．剪刀類(scissors)

用于切斷莖段、葉片等。也可用彎形剪刀，可以深入到瓶口中進行剪切。3．解剖刀

切割較小材料和分離莖尖分生組織。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時會造成擠壓，引起周圍細胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。4．解剖針

解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉，可自制。

第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日10、微孔過濾器（細胞過濾器）滅菌用：如激素一般用石棉濾膜第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日第二節(jié)無菌操作一、滅菌菌：細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學的滅菌方法處理后的物體。滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚壁孢子等不會完全殺死，無菌操作：通過嚴格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作。第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類：物理方法：干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法：使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當選用。具體措施如下：第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日1、濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃?？蓺⑺栏鞣N細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，使鍋內(nèi)均勻升溫,滅菌才能徹底。常用排氣方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時壓力，20min。第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基滅菌要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌后的培養(yǎng)基，其pH值下降單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。培養(yǎng)基中成分單一時和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基pH值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，蔗糖水解大大增強。第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時采取有效措施。(2)設(shè)計培養(yǎng)基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。(3)配制培養(yǎng)基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復動態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。在實驗中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日2.灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰處灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。

第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日3.干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）原理：利用烘箱加熱到160-180℃殺死微生物。在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應漸進升溫，達到預定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，待充分冷涼，才能打開烘箱。缺點：能源消耗太大，浪費時間。第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日4.過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素不耐熱，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45μm以下，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜網(wǎng)孔直徑而被阻。在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日5.紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌使細菌蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。紫外線以260nm的殺菌能力最強，但穿透物質(zhì)的能力很弱，只適于空氣和物體表面的滅菌，且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌加熱焚燒、氧化等使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散，以殺死空氣和物體表面的微生物。方法簡便。常用：甲醛，用量5-8ml/m3，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可。

化學消毒劑的種類很多，一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，消毒劑要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。消毒劑一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日6.噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，70-75%的酒精反復涂擦滅菌l%-2%的來蘇兒溶液0.25%-1%的新潔爾滅第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日7.植物材料表面消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理。材料經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上的過程叫做接種。主要步驟：第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第一步：材料水洗

切割成適當大小。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，再用自來水沖凈洗衣粉水。可除去輕度附著在植物表面的污物，脂質(zhì)性的物質(zhì)。最理想的清洗物表面活性物質(zhì)：吐溫。第二步：對材料的表面浸潤滅菌。在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。

酒精使植物材料表面易被浸濕，70%酒精穿透力強，易殺傷植物細胞，故浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，酒精處理可稍長。第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日第三步：滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用。常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9-105-30易很好次氯酸鈉25-30易很好氯化汞0.1-15-8較難最好抗菌素4-50mg/L30-60中較好第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日除氯化汞，上述滅菌劑應現(xiàn)配現(xiàn)用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液。在滅菌溶液中加吐溫-80或TritonX效果較好，使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應注意吐溫的用量和滅菌時間。第四步：無菌水涮洗，每次3min左右，涮洗3-l0次左右。可免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。升汞殘毒較難去除，應當多洗幾次。第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日二、無菌操作接種時由于有一個敞口的過程，極易引起污染，主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%-3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日(1)接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌；(2)接種前20min，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；(3)先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時，雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日三、接種(1)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈?。如葉片：0.5cm見方的小塊；莖：含有一個節(jié)的小段。微莖尖剝成只含l-2片幼葉。接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(2)將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體過程是：揭開蓋子試管口過火夾取材料插入培養(yǎng)基試管口過火加蓋子先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。加蓋。第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日第三節(jié)培養(yǎng)基組成及母液配制培養(yǎng)基culturemedium是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。在植物組織培養(yǎng)歷史進程中，事實上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對植物的營養(yǎng)要求的不斷認識，對已有培養(yǎng)基的改進，或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應用于培養(yǎng)基之中，都大大促進了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展。

第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日

一、培養(yǎng)基的種類

根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對綠色植物的成分進行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機鹽營養(yǎng)，設(shè)計出了由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基得到廣泛應用。以后根據(jù)不同目的進行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡

培養(yǎng)基的名稱，多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)，也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日常用的培養(yǎng)基及特點如下：(1)MS培養(yǎng)基1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。

(2)B5培養(yǎng)基1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。

(3)White培養(yǎng)基1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4：的濃度和增加了硼素。其特點是無機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。

第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日(4)N6培養(yǎng)基1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KN03和(NH4)2S04含量高。在國內(nèi)已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。

(5)KM-8P培養(yǎng)基1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日MS培養(yǎng)基成分表成分母液MS培養(yǎng)基大量元素NH4NO3KNO3CaCl2·H2OKH2PO4MgSO4·7H2O

mg/L(100×)165000190000440001700037000mg/L16501900440170370第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日微量元素mg/L(100×)mg/LMnSO4·4H2OZnSO4·4H2OH3BO3KINa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2O

223086062083252.52.522.38.66.20.830.250.0250.025第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日鐵鹽Na2EDTAFeSO4·7H2O

mg/L(100×)37252785mg/L37.2527.85有機物質(zhì)甘氨酸硫銨素煙酸鹽酸吡哆醇肌醇

mg/L(100×)20040505010000mg/L2.00.40.50.5100第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日二、培養(yǎng)基的成分

水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1．水

水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。

2、無機元素(inorganicelement)指濃度大于0.5mmol／L的元素：N，P，K，Ca，Mg，S等。(1)N

蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分。在制備培養(yǎng)基時以N03-N和NH4-N兩種形式供應。NH4-N對植物生長較為有利。供應的物質(zhì)有KN03、NH4NO3等。也可添加氨基酸。

第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日(2)P：磷脂的主要成分。磷脂又是原生質(zhì)、細胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。

(3)K：和碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大，一般為1-3mg／L為好。制備培養(yǎng)基時，常以KCl、KNO3等鹽類提供。

第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日(4)Mg、S和Ca

Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgS04·7H20提供。用量為1-3mg／L較為適宜；Ca是構(gòu)成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2·2H20提供。(5)微量元素指小于0.5mmol／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進作用。在制做培養(yǎng)基時不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其在pH值5.2以上，易形成不溶性沉淀)，而用FeS04·7H20和Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，缺少這些物質(zhì)會導致生長、發(fā)育異常現(xiàn)象。第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日3．有機化合物(organiccompound)培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機物以利于快速生長。常加入的有機成分主要有以下幾類：(1)碳水化合物

常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也可，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應用。蔗糖使用濃度在2％-3％，常用3％，但在胚培養(yǎng)時采用4％-15％的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。不同植物不同組織的糖類需要量也不同。高壓滅菌時一部分糖發(fā)生分解、制定配方時要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時，綿白糖成本低。

第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日(2)維生素(vitamin)

主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。大多數(shù)的植物細胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素。主要有VB1(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、VC(抗壞血酸)、有時還使用Wh生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.1-1.Omg／L。有時用量較高。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。

第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日(3)肌醇又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進一步形成磷脂，參與細胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為100mg／L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。(4)氨基酸(aminoacide)很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時應用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之間。營養(yǎng)豐富，極易引起污染。

第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日(5)天然復合物成分比較復雜，大多不清楚，多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。一般應盡量避免使用。1)椰乳椰子的液體胚乳。是使用最多、效果最大的一種天然復合物。一般使用濃度在10％-20％，與其果實成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時，椰乳就不發(fā)生作用。

2)香蕉用量為150-200ml/l。用黃熟的香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙H值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對發(fā)育有促進作用。

第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日3)水解酪蛋白蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100-200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用時要注意。4)其他酵母提取液(YE)(0.01％-0.05％)，成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0．01％-0．5％)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日4．植物激素(hormone)激素：能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許多的生理生化活動，在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。(1)生長素類(auxin)

主要用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，就可促進生長，其次是莖和芽。

天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。第六十二頁，共七十頁，2022年，8月28日IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)天然存在，亦可人工合成，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，受光也易分解。NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)起動能力比IAA高3-4倍，可人工合成，耐高溫高壓，應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。IBA(indolebutyricacid吲哚丁酸)促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。

生長素配制時可先用少量95％酒精助溶。2,4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。生長素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。

第六十三頁，共七十頁，2022年，8月28日(2)GA(gibberellicacid赤霉素)有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同。常用的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。赤霉素溶于酒精，配制時可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％-100％失效，應當采用過濾滅菌法加入。

第六十四頁，共七十頁，2022年，8月28日(3)細胞分裂素類(cytokinin)這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、KT(kinetin激動素)、ZT(zeatin玉米素)等。其中ZT活性最強，但非常昂貴，常用的是6-BA。

細胞分裂素有三個作用：①誘導芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內(nèi)細胞分裂素／生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進細胞分裂與擴大。③抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用