微核試驗(yàn)課件

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)受試物:環(huán)磷酰胺受試動(dòng)物:小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的原理和方法

細(xì)胞分裂分為四個(gè)期：1、G1期（DNA合成前期）：細(xì)胞生長，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備。2、S期（DNA合成期）：體細(xì)胞的DNA含量由2C增加到4C3、G2期(DNA合成后期)：該期主要為M期作準(zhǔn)備，包括復(fù)制因子的失活和有絲分裂促進(jìn)因子的分化,有關(guān)細(xì)胞骨架系統(tǒng)重新組裝的蛋白質(zhì)合成4、M期(有絲分裂期)：前期，早中期，中期，后期（微核形成期），末期圖13-1細(xì)胞周期可劃分為四個(gè)階段

微核（micronucleus）

是染色體或染色單體的無著絲點(diǎn)片斷或紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，于細(xì)胞分裂后期留在細(xì)胞質(zhì)中，末期后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，比主核小，故叫微核。

原理：1有絲分裂毒物的作用使個(gè)別染色體或帶著絲點(diǎn)的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被滯留在細(xì)胞質(zhì)中2斷片或無著絲點(diǎn)染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，從而遺留在細(xì)胞質(zhì)中

結(jié)論：

微核試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)化學(xué)或其他物質(zhì)因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)微核可出現(xiàn)于多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中難以與正常核的分葉及核突出物區(qū)分，故常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核，因?yàn)樵诖穗A段，主核排出，易于觀察微核，這些細(xì)胞保持其嗜堿性約24小時(shí)，然后成為正染紅細(xì)胞（NCE）,并進(jìn)入外周血。注：在主核排除時(shí)，微核仍保留在細(xì)胞中操作步驟：一

染毒：染毒途徑：腹腔注射環(huán)磷酰胺，染毒二次，

0、24小時(shí)各染毒一次，6h后取樣染毒劑量：50mg/kg二

處死：頸椎脫臼法處死小鼠

三：骨髓液的制備和涂片

1處理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每節(jié)骨骺，用彎止血鉗將骨髓擠于預(yù)先滴有小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片

2固定：將推好涼干的骨髓片放進(jìn)染色缸，甲醇固定15分鐘，取出晾干

3染色：用新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液（Giemsa儲(chǔ)備液一份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份）染色10－15分鐘，細(xì)流水沖掉玻片染色液，晾干四觀察和計(jì)數(shù)：１觀察：先用低倍鏡觀察，選擇分布均勻的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）桔黃色。細(xì)胞中的微核大半呈圓形，邊緣光滑，嗜色性與核質(zhì)一致，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。２計(jì)數(shù)：1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中PCE/NCE的比值結(jié)果與分析：

1結(jié)果：試驗(yàn)只計(jì)數(shù)PCE中的微核，微核率以千分率表示。每組的雌雄動(dòng)物分開計(jì)數(shù)微核PCE均值。2分析：正常的PCE/NCE比值為1（0.6-1.2），如果＜0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如果＜0.05，則表示受試物劑量過大，結(jié)果不可靠。

圖1：正常嗜多染紅細(xì)胞PCE（×400）圖2帶微核嗜多染紅細(xì)胞MNPCE（×400）微核嗜多染細(xì)胞注意事項(xiàng)：

1、剪胸骨時(shí)通過剪斷兩邊的肋骨來把整塊胸骨取下來，以防不小心把胸骨剪斷

2、擠出骨髓處的肌肉要剔除干凈

3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂時(shí)要涂勻，以便推片

4、染色前可以先看一下整體涂片情況，細(xì)胞分散度是否良好

5、關(guān)鍵步驟是制作良好的骨髓涂片以及優(yōu)良的染色流程圖

處死小鼠，取胸骨

推片

固定（甲醇固定15分鐘）

染色（吉姆薩染色15分鐘）

觀察并