GB/T 22333-2008日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

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２００８０８２２發(fā)布２００８１２０１實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

書(shū)

犌犅／犜２２３３３—２００８

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏偉、孫明、王傳彬、陳西釗、田克恭。

Ⅰ

書(shū)

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了日本乙型腦炎病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物腦組織中日本乙型腦炎病毒核酸的檢測(cè)。

２試劑

２．１變性液（見(jiàn)第Ａ．１章）。

２．２２ｍｏｌ／Ｌ乙酸鈉溶液（ｐＨ４．０）。

２．３酚三氯甲烷異戊醇混合液（見(jiàn)第Ａ．２章）。

２．４２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。

２．５８ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物混合液（引物序列見(jiàn)第Ａ．３章）。

２．６１０倍ＰＣＲ緩沖液。

２．７１％溴化乙錠（ＥＢ）溶液。

２．８ＴＡＥ電泳緩沖液。

２．９１％瓊脂糖凝膠。

２．１０上樣緩沖液（見(jiàn)第Ａ．４章）。

２．１１其他試劑：１０Ｕ／μＬＡＭＶ反轉(zhuǎn)錄酶、１００ｂｐＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物、５０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制劑、

５Ｕ／μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、異丙醇、７５％乙醇溶液、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂溶液、ＤＥＰＣ處理過(guò)的無(wú)菌雙

蒸水。

３實(shí)驗(yàn)室條件

３．１實(shí)驗(yàn)室級(jí)別要求

實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅲ級(jí)（ＢＳＬ３級(jí)）實(shí)驗(yàn)室。

３．２實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

ＲＴＰＣＲ試驗(yàn)區(qū)域分反應(yīng)液配制區(qū)（配液區(qū)）、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→

核酸提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

３．３實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備的儀器及耗材

３．３．１儀器：分析天平、高速離心機(jī)、真空干燥器、ＰＣＲ擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫

外分析儀）、液氮罐或－７０℃冰箱、微波爐、組織研磨器、－２０℃冰箱、水浴鍋、可調(diào)移液器（最大量程分

別為２μＬ、２０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）。

３．３．２耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、１０ｍＬ一次性注射器、１．５ｍＬ滅菌離心管、０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲ

管、瓊脂糖、５００ｍＬ