課題-多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR技術簡史1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎

PCR原理

細胞內參與DNA復制的各種組成成分

與反應條件

DNA復制的知識解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3’端開始連接脫氧核苷酸

思考：體內DNA復制的條件是什么？

DNA的合成方向DNA雙鏈的方向，區(qū)分DNA的3′端和5′端DNA復制方向示意圖DNA變性和復性示意圖TaqDNA聚合酶的應用DNA聚合酶的特性，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈、而不能從頭合成DNA高溫導致DNA聚合酶失活課題2“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”Taq細菌的發(fā)現過程PCR技術與體內DNA復制的區(qū)別：

1.PCR不需要解旋酶；體內DNA復制需要；

2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內的聚合酶在高溫時會變性；

3.PCR一般要經歷三十多次循環(huán)，而生物體內DNA復制需要生物體自身的復制。PCR的反應過程一般采用變性-復性-延伸三步循環(huán)。

⑴變性：將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到95℃，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。⑵復性：通過降低反應溫度至55℃，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3`端粘合。⑶延伸：將反應溫度提高到約72℃，在耐熱DNA聚合酶的催化下，合成兩條互補鏈，從而使模板DNA擴增一倍。按照上述步驟重復操作約30次，即可將模板DNA擴增數百萬倍。三、實驗步驟：準備好PCR反應體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應液離心10分鐘將離心管放入PCR儀上，設置好循環(huán)程序進行反應注意事項：詳見操作提示

四、結果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調零→測定→計算（公式見P63）波長260nm處讀數蒸餾水做對照50倍練習鞏固1、關于PCR技術的應用，錯誤的一項是A古生物學、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術最突出的優(yōu)點是A原理簡單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是A