第六章-熒光分光光度法

第六章

熒光分光光度法

基本要求：了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。了解熒光分光光度計(jì)的組成以及特點(diǎn)。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強(qiáng)度的因素。第一節(jié)概論

回顧：四大類(lèi)電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法原子光譜法分子光譜法X射線(xiàn)光譜法核磁波譜法紫外-可見(jiàn)光分光光度法熒光分光光度法紅外吸收光譜法拉曼光譜法一、應(yīng)用：

1.定量分析能產(chǎn)生熒光或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡(jiǎn)單定性回答“是不是”。二、特點(diǎn)：

靈敏度高，比吸收光譜法高103~104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。第二節(jié)

基本原理

一、分子熒光的產(chǎn)生物質(zhì)吸收光輻射價(jià)電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài)釋放能量⒈以熱能的形式。⒉以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時(shí)，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱(chēng)為光致發(fā)光。熒光磷光無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài)

最常見(jiàn)的光致發(fā)光：熒光和磷光。兩者發(fā)光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-9～10-6秒，磷光壽命10-3～10秒。熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。由于熒光的產(chǎn)生由價(jià)電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長(zhǎng)范圍位于：紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)。二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

⒈激發(fā)光譜固定熒光波長(zhǎng)，以激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度(F)所作的光譜曲線(xiàn)。300350400λ(nm)

F【例】硫酸奎寧（0.1mol/L硫酸溶液）的激發(fā)光譜。⒉

發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，以熒光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度F所作的光譜曲線(xiàn)。300350400λ(nm)

F【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。三、分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見(jiàn)光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結(jié)構(gòu)

【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。四、熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系

Φ：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。I0：入射光強(qiáng)度ε：摩爾吸光系數(shù)b：光程c：濃度F=2.303ΦI0εbc公式成立前提條件：εbc=A<0.05

即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c<0.05/εb），C與F方成線(xiàn)性。（如果濃度過(guò)高，分子碰撞機(jī)會(huì)增大，而產(chǎn)生無(wú)輻射去激活，造成線(xiàn)性偏離。）第三節(jié)

熒光分光光度計(jì)

一、基本結(jié)構(gòu)示意圖

特點(diǎn)：1．光源方向與檢測(cè)方向成直角；2．二個(gè)單色器?！わ@示器檢測(cè)器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源二、主要部件及功能

1．光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見(jiàn)光，光強(qiáng)度比紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)光源大得多。2．激發(fā)光單色器作用：提供單波長(zhǎng)的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào)。3．樣品池須用石英材料制成。4．熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過(guò)。出射狹縫寬度可調(diào)。5．檢測(cè)器光電轉(zhuǎn)換元件，測(cè)定熒光的強(qiáng)度。檢測(cè)方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒(méi)有透過(guò)光的干擾。由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。第四節(jié)

定量分析

一、定量方法一般采用工作直線(xiàn)法。作C—F直線(xiàn)。FC⑴配制一系列待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液C1C2C3C4C5⑵測(cè)出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度F1F2F3F4F5⑶建立工作直線(xiàn)（F

→C）①作圖法②回歸法⑷測(cè)量待測(cè)樣品，得F樣①?gòu)墓ぷ髦本€(xiàn)上找到待測(cè)成分的濃度C樣②由回歸方程計(jì)算出C樣二、影響熒光強(qiáng)度測(cè)定的因素

1．激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)致F↓。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2．溫度溫度↑，熒光效率下降，F(xiàn)↓。（因?yàn)?，溫度↑，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）4．溶劑有些溶劑會(huì)使熒光效率下降，也可能帶來(lái)干擾熒光。

苯胺pH7～12時(shí)，發(fā)蘭色熒光。pH﹤2或PH﹥13時(shí)，無(wú)熒光?！纠克?，有時(shí)需要pH緩沖液控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。3．pH值

pH值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強(qiáng)度。靈敏度高?？筛哌_(dá)ppb級(jí)（10-9），甚至ppt級(jí)（10-12）。選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用

思考題一、概念（熒光）激發(fā)光譜（熒光）發(fā)射光譜二、問(wèn)答題試述分子熒光產(chǎn)生的過(guò)程。試述分子熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系式，并說(shuō)明公式成立的前提條件及原因。分別說(shuō)明熒光分光光度計(jì)兩個(gè)單色器的作用，以及將光路設(shè)計(jì)成直角方向的原因。為什么可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光