第4章-藥物定量分析

第四章

藥物定量分析與

分析方法驗(yàn)證第一節(jié)

含金屬或鹵素有機(jī)藥物

的前處理方法

一．有機(jī)藥物中金屬或鹵素的結(jié)合狀態(tài)二．不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法三．經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法1．含金屬的有機(jī)藥物金屬原子不直接與碳原子相連

----結(jié)合不牢固有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物。金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連

----結(jié)合牢固

有機(jī)金屬藥物一．有機(jī)藥物中金屬或鹵素的結(jié)合狀態(tài)2．含鹵素的有機(jī)藥物鹵素和芳環(huán)相連：

結(jié)合牢固鹵素和脂肪鏈的碳原子相連：

結(jié)合不牢固（一）直接測(cè)定法適用于：水溶液中可以電離的藥物二．不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物某些C-M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物如富馬酸亞鐵的含測(cè)直接回流后測(cè)定法：

適用于鹵素原子結(jié)合不牢固的含鹵素有機(jī)藥物

三氯叔丁醇的含測(cè)/六氯對(duì)二甲苯硫酸水解后測(cè)定法：

適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬的有機(jī)藥物。

硬脂酸鎂的含測(cè)（二）經(jīng)水解后測(cè)定法1．堿性還原后測(cè)定適用于鹵素原子和芳環(huán)結(jié)合的含鹵素有機(jī)藥物。生成的無(wú)機(jī)鹵化物用銀量法測(cè)定.2．酸性還原后測(cè)定

同上3．利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測(cè)定含量含Sb5+藥物，含F(xiàn)e3+藥物（三）經(jīng)氧化還原后測(cè)定法

適用于結(jié)合狀態(tài)牢固的有機(jī)金屬藥物和含鹵素有機(jī)藥物（一）濕法破壞利用強(qiáng)氧化劑將有機(jī)金屬轉(zhuǎn)變成金屬離子。1．硝酸-高氯酸法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞。破壞后的金屬離子以高價(jià)態(tài)存在。對(duì)含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全。三．經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法2．硝酸-硫酸法適用于大多數(shù)有機(jī)藥物的破壞，但不適用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞。（生成硫酸鹽沉淀）破壞后的金屬離子以高價(jià)態(tài)存在。３．硫酸-硫酸鹽法常用于含砷或銻有機(jī)藥物的破壞，得到低價(jià)態(tài)的三價(jià)砷或銻離子。（二）干法破壞

----將有機(jī)物灼燒灰化適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)藥物及某些不能用硫酸破壞的有機(jī)藥物不適用于含易揮發(fā)金屬有機(jī)藥物的破壞（砷、汞）常加入無(wú)水碳酸鈉或輕質(zhì)氧化鎂助灰化

-----是一種能將有機(jī)化合物中的待測(cè)元素定量分解成離子的快速有機(jī)破壞方法應(yīng)注意的有關(guān)問題：氧氣要充足，確保燃燒完全燃燒產(chǎn)生的煙霧應(yīng)被完全定量吸收（三）氧瓶燃燒法

oxygenflaskcombustionmethod樣品點(diǎn)燃放入燃燒瓶后，應(yīng)用手按緊瓶塞（最好用少量水封閉瓶口），直到火焰熄滅，以防燃燒產(chǎn)生的熱氣將瓶塞頂動(dòng)；測(cè)定氟化物，應(yīng)用石英燃燒瓶。生成的HF腐蝕玻璃，且與玻璃中的硼生成BF3(BF3在水溶液中僅部分解離成氟離子，使氟的測(cè)定結(jié)果偏低)；燃燒瓶洗凈；防爆。第二節(jié)

定量分析方法特點(diǎn)一．容量分析法二．光譜分析法三．色譜分析法一．容量分析法1．方法：2．關(guān)鍵：

準(zhǔn)確地確定等當(dāng)點(diǎn)3．滴定誤差：滴定終點(diǎn)與等當(dāng)點(diǎn)之間的誤差

將已知濃度的滴定液由滴定管加到待測(cè)藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測(cè)藥物按化學(xué)計(jì)量反應(yīng)完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可以計(jì)算出被測(cè)藥物的含量滴定液與被測(cè)藥物完全作用，反應(yīng)達(dá)到化學(xué)計(jì)量點(diǎn)即等當(dāng)點(diǎn)4．特點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，精密、準(zhǔn)確專屬性、靈敏度較差

常用于測(cè)定高含量或中含量組分

1%以上的含量5．計(jì)算問題滴定度T：指每ml某摩爾濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物的重量

aA+bB

?

cC+dDT=M×(b/a)×B（mg/ml）

M:滴定液的毫摩爾濃度(mmol/ml)；

B:被測(cè)藥物的毫摩爾質(zhì)量(mg/mmol)百分含量計(jì)算：直接滴定：含量%=F=滴定液的實(shí)際摩爾濃度/滴定液的規(guī)定摩爾濃度剩余滴定（做空白實(shí)驗(yàn)）：先加入定量過量的滴定液A,當(dāng)與被測(cè)藥物反應(yīng)完全后,再用另一滴定液B回滴剩余的滴定液A

含量%=

V0：空白試驗(yàn)消耗滴定液B的體積

VB：樣品測(cè)定試驗(yàn)消耗滴定液B的體積二．光譜分析法1．Lambert-Beer定律ε：摩爾吸收系數(shù)：百分吸收系數(shù)

ε=×(M/10)（一）UV-Vis分光光度法2．儀器校正和檢定波長(zhǎng)校正：儀器使用前校正吸收度準(zhǔn)確度的檢定：用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定雜散光的檢查：3.對(duì)溶劑的要求溶劑在所選波長(zhǎng)附近的吸收度應(yīng)不超過一定值空氣為空白4．測(cè)定法核對(duì):

供試品的實(shí)際吸收峰波長(zhǎng)是否與藥典給出的波長(zhǎng)一致(±1nm)

如果不一致，可能與試樣的真?zhèn)?、純度及儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度有關(guān).選擇合適的定量方法測(cè)定校正曲線法對(duì)照法吸收系數(shù)法:

儀器應(yīng)仔細(xì)校對(duì)、檢定計(jì)算分光光度法以配制供試品溶液的同批溶劑為空白1．特點(diǎn)應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行

高濃度：產(chǎn)生內(nèi)濾光效應(yīng)和自吸收現(xiàn)象線性偏離內(nèi)濾光效應(yīng)：溶液中存在能吸收激發(fā)光和熒光的物質(zhì)，使熒光強(qiáng)度減少。干擾多，需做空白試驗(yàn)（二）熒光分析法校正儀器靈敏度：供試品對(duì)激發(fā)光穩(wěn)定：可用樣品的對(duì)照品溶液校正供試品對(duì)激發(fā)光不穩(wěn)定：

采用發(fā)射光譜與供試品近似的物質(zhì)校正

藍(lán)色熒光---硫酸奎寧的稀硫酸溶液黃綠色熒光---熒光素鈉水溶液紅色熒光---羅丹明B水溶液2．含量測(cè)定

Cx=×Cs

0.5-2.0

熒光強(qiáng)度與藥物濃度成正比關(guān)系1．HPLC法最常用固定相：

octadecylsilane-bondedsilicagel

十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18）柱溫、檢測(cè)器：

室溫、紫外檢測(cè)器三.色譜分析法藥典正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分和檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余條件如色譜柱內(nèi)經(jīng)、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、流動(dòng)相流速及各組分比例等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體樣品品種及達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱的理論塔板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子色譜柱的理論塔板數(shù)N=5.54(tR/W1/2)2=16(t/W)2

改變柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、固定相牌號(hào)、固定相顆粒粒徑等

定量峰與其它峰或內(nèi)標(biāo)峰之間的分離度R應(yīng)大于1.5分離度取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測(cè)量值的RSD不應(yīng)大于2.0%配制相當(dāng)于80%，100%，120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其RSD不應(yīng)大于2.0%重復(fù)性

T=W0.05h/2AW0.05h：0.05峰高處的峰寬

A：峰前沿與色譜峰頂點(diǎn)至基線的垂線之間的距離峰高法定量：T應(yīng)在0.95-1.05之間拖尾因子藥物分析中常用的HPLC定量方法：內(nèi)標(biāo)法：

內(nèi)標(biāo)校正曲線法內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：對(duì)照法內(nèi)標(biāo)校正因子法外標(biāo)法：

標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)一點(diǎn)法：對(duì)照法2．氣相色譜法藥典正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定液品種、檢測(cè)器類型及特殊指定的色譜柱材料不得任意改變外，其余條件如色譜柱內(nèi)經(jīng)、長(zhǎng)度、載體牌號(hào)、載氣流速等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：同HPLC定量方法：手動(dòng)進(jìn)樣：內(nèi)標(biāo)法消除較大的進(jìn)樣誤差留針時(shí)間、氣化室高溫自動(dòng)進(jìn)樣：內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法頂空進(jìn)樣：標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法(內(nèi)加法)

消除基質(zhì)效應(yīng)的影響供試品和對(duì)照品處于不完全相同的基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定主成分含量，再扣除加入的對(duì)照品溶液含量，即得供試品溶液中主成分含量。外標(biāo)法按下述公式進(jìn)行計(jì)算：加入對(duì)照品溶液前、后校正因子應(yīng)相同，即：Cx和Ax：供試品中組分X的濃度和色譜峰面積；△Cx：所加入的已知濃度的待測(cè)組分對(duì)照品的濃度；Ais：加入對(duì)照品后組分X的色譜峰面積。第三節(jié)

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法

驗(yàn)證

需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目：鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)限度或定量檢查原料藥或制劑中有效成分的含量測(cè)定制劑中其它成分的含量測(cè)定溶出度、釋放度測(cè)定方法

需驗(yàn)證的內(nèi)容：準(zhǔn)確度精密度專屬性檢測(cè)限定量限線性線性范圍耐用性一．準(zhǔn)確度高、中、低三個(gè)濃度，每個(gè)濃度3份1．原料藥：

用已知純度的對(duì)照品測(cè)定。2．制劑：用含已知量被測(cè)物（對(duì)照品）的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定－－回收率若不能得到制劑的全部組分，可向已測(cè)定含量的制劑中加入已知量待測(cè)物（對(duì)照品）進(jìn)行測(cè)定。

－－加樣回收率1．表示方法

標(biāo)準(zhǔn)偏差SD

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

relativestandarddeviationRSD

即變異系數(shù)

coefficientofvariationCV二．精密度2.重復(fù)性在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定同一種樣品所得結(jié)果的精密度。

日內(nèi)精密度測(cè)定高、中、低3個(gè)不同濃度的樣品，每個(gè)濃度測(cè)定3-5份樣本?；蛞环N濃度的溶液連續(xù)測(cè)定6次。3．中間精密度在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室、不同時(shí)間由不同分析人員用不同儀器測(cè)定結(jié)果的精密度。常做日間精密度

由于測(cè)定持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，往往在同一天內(nèi)不能完成，故樣品測(cè)定時(shí)使用的儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生變化，而使測(cè)定結(jié)果發(fā)生變化。４．重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。若分析方法作為法定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)做指樣品中有其他成分存在時(shí)，分析方法能準(zhǔn)確測(cè)定出待測(cè)藥物的特性鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定：均考察專屬性對(duì)鑒別反應(yīng)：不含被測(cè)藥物的樣品，應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)三．專屬性對(duì)雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定：待測(cè)成分應(yīng)能與其它成分分離給出代表性圖譜，說明專屬性若無(wú)雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸破壞、堿破壞、氧化破壞的方法，產(chǎn)生雜質(zhì)和降解產(chǎn)物．指待測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量。反映：分析方法與儀器的靈敏度、儀器的噪音大小、

樣品經(jīng)處理后空白值的高低。

四．檢測(cè)限

limitofdetection,LOD１．UV-Vis和熒光分光光度法做多次空白試驗(yàn)，求背景響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，則:LOD=3SD有時(shí)用校正系數(shù)進(jìn)行校正：UV-Vis：

LOD=f×3SD=（C樣

/A樣）×3SD熒光分析：

LOD=f×3SD=[C樣

/（F樣-F空）]×3SD2．色譜法

S/N=2或3時(shí)的對(duì)應(yīng)濃度或注入儀器的量指待測(cè)物能被定量測(cè)定的最低濃度或量。能滿足一定準(zhǔn)確度和精密度的要求S/N=10時(shí)，待測(cè)物濃度或注入儀器的量五．定量限limitofquantitation,LOQ在一定濃度范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與樣品中待測(cè)物濃度或量直接呈正比關(guān)系的程度。UV法：C~A色譜法：C~HorA數(shù)據(jù)要求：回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。至少5個(gè)點(diǎn)六．線性達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。通常指線性范圍七．范圍

當(dāng)測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。常見變動(dòng)因素：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性；樣品提取次數(shù)、時(shí)間等；HPLC中：流動(dòng)相組成和pH，色譜柱的廠牌、批號(hào)，柱溫，流動(dòng)相流速等；GC中：色譜柱的廠牌、批號(hào)，固定相和載體的類型，柱溫等。八．耐用性

驗(yàn)證分析方法的具體內(nèi)容

鑒別雜質(zhì)檢查含量測(cè)定及溶出度測(cè)定定量限度準(zhǔn)確度－＋－＋重復(fù)性精密度中間精密度－－＋＋*－－＋＋*專屬性＋＋＋＋檢測(cè)限－－**＋－定量限－＋－－線性－＋－＋范圍－＋－＋耐用性＋＋＋＋*已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，則不需**視具體情況予以驗(yàn)證第四節(jié)

生物樣品分析概述

一．常用樣品的種類、采集和貯藏二．生物樣品分析預(yù)處理技術(shù)三．定量分析方法驗(yàn)證常用品種：血液、尿液、唾液其次：可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。（一）生物樣品一．常用樣品的種類、采集和貯藏

1．血樣

血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血（加抗凝劑）血液采樣與保存采樣：保存：血樣（血漿、血清）及時(shí)分離→冷藏或-70℃，有時(shí)加入穩(wěn)定劑

穩(wěn)定劑：酶抑制劑（NaF、三氯醋酸），抗氧劑解凍方法：

2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除率，藥物代謝和生物利用度特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)作水解處理保存：立即測(cè)定（尿中含水、無(wú)機(jī)鹽、尿素等）；4℃保存；放置較長(zhǎng)時(shí)間需冷凍；加入防腐劑（1%甲苯；飽和氯仿）或改變pH1、預(yù)處理的目的存在形式的多樣性：游離、結(jié)合物、代謝物濃度低，雜質(zhì)多出現(xiàn)渾濁和沉淀影響色譜柱壽命二．生物樣品分析預(yù)處理技術(shù)藥物理化性質(zhì)：

pKa

親脂性揮發(fā)性溶解度穩(wěn)定性光譜特征與蛋白的結(jié)合程度濃度范圍：

測(cè)定目的：定性定量母體代謝生物樣品的種類：樣品處理與分析方法的選擇

①專一性②靈敏性2、預(yù)處理方法選擇的一般原則3、生物樣品中蛋白質(zhì)的處理（1）目的：去除蛋白質(zhì)，使結(jié)合型藥物和代謝物釋放出來，便于測(cè)定總濃度；預(yù)防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成；保護(hù)儀器性能。（2）方法：蛋白質(zhì)沉淀劑法與水相混溶的有機(jī)溶劑：乙腈，甲醇，乙醇，丙酮，THF中性鹽：飽和硫酸銨，硫酸鈉，磷酸鹽，

NaCL

，

枸櫞酸鹽強(qiáng)酸：三氯醋酸，高氯酸，硫酸-鎢酸混合液含鋅鹽和酮鹽的沉淀劑：

CuSO4-Na2WO4,ZnSO4-NaOH酶解法適用于遇酸不穩(wěn)定及與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固的藥物常用蛋白水解酶中的枯草菌溶素（細(xì)菌性堿性蛋白分解酶）微孔濾膜法用于測(cè)定樣品中的游離藥物或代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物不能濾過。4、生物樣品中綴合物的水解（1）目的：使綴合物中的藥物或代謝物游離，便于用有機(jī)溶劑提取綴合物的極性較大（2）方法酸水解法：鹽酸酶解法：

β-葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶，二者的混合酶；

溶劑解某些藥物的硫酸酯，往往加入提取溶劑時(shí)發(fā)生分解，同時(shí)提取到有機(jī)溶劑中5、生物樣品中藥物或代謝物的萃取液-液提取提取率在有機(jī)相與水相中溶解度的比值；一般少量多次，提取率高對(duì)生物樣品：樣品量少、樣品數(shù)多、藥物含量低，一般一次萃取（至多兩次），提取率一般應(yīng)>50%

影響提取率的因素水相pH：堿性藥物在堿性pH，酸性藥物在酸性pH提取溶劑：相似相溶原理。沸點(diǎn)低，不影響檢測(cè)，性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)離子強(qiáng)度：加入中性鹽，增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取提取次數(shù)：提取-反提取離子對(duì)提取適用于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物藥物含陰離子：-COO--SO3-

離子對(duì)試劑：烷基季銨鹽藥物含陽(yáng)離子：-NH+

離子對(duì)試劑：烷基或芳基磺酸鹽

乳化問題預(yù)防措施：

①輕緩振搖；

②不溶物應(yīng)過濾掉

③避免在高pH條件下，從水中提取藥物

④避免使用易發(fā)生乳化的溶劑對(duì)：如水-苯，水-己烷

⑤萃取前水相中加入少量NaCl

乳化問題破乳方法：

①機(jī)械法

②加乙醇或少量高級(jí)脂肪醇,改變表面張力

③改善混合溶劑比例，增加分散相的百分?jǐn)?shù)液-固提取操作步驟：①固相柱選擇：依據(jù)樣品體積、被測(cè)物的量及理化性質(zhì)②固相柱處理反相C18：固定相的6-10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化；6-10倍緩沖液沖洗達(dá)分離狀態(tài)③上樣④分離：用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈煜慈ルs質(zhì)，通N2干燥固相柱⑤洗脫待測(cè)物：改變洗脫劑pH或極性影響液-固提取的因素流速

上樣流速快：按觸不充分，樣品流失,回收率低裝樣：過載樣品突破性試驗(yàn)：一系列體積的已知濃度樣品液上樣，洗脫后，求回收百分率；當(dāng)回收率下降時(shí)為過載。柱切換HPLC：兩個(gè)泵，預(yù)柱，分析柱固相微萃取SPME：6、生物樣品中待測(cè)組分的濃集

避免直接加熱濃縮7、生物樣品中待測(cè)組分的衍生化處理

GC衍生化

HPLC衍生化生物樣品中藥物和代謝物的定量分析方法：首先色譜法，內(nèi)標(biāo)法定量驗(yàn)證的關(guān)鍵：

專屬性、靈敏度三．定量分析方法驗(yàn)證須證明待測(cè)物是原形藥物或特定代謝物，且其測(cè)定不受其他物質(zhì)的干擾。需提供的色譜圖:空白生物樣品

質(zhì)控樣品

用藥后生物樣品1.專屬性或選擇性

specificity,selectivity至少6個(gè)濃度點(diǎn)，不包括零點(diǎn)使用與生物樣品相同