第二章紫外-可見分光光度法

第2章紫外-可見分光光度法吸光光度法基本原理光度計及其基本部件顯色反應及顯色條件的選擇吸光度測量條件的選擇3.1

概述吸光光度法——基于物質對光的選擇性吸收的分析方法比色法比較有色溶液對溶液透過光的強度可見分光光度法紫外分光光度法CuSO4溶液KMnO4溶液為什么這些溶液呈現不同的顏色？Fe3＋＋SCN－→[Fe(SCN)]2＋比較有色溶液對某一波長光的吸收物質顏色與吸收光顏色的互補關系/nm吸收光顏色400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-760紅藍綠

當λ＝200－400nm:（近）紫外區(qū)，紫外分（吸）光光度法

λ＝400－750nm:

可見光區(qū)，可見分（吸）光光度法電磁輻射波動性周期T頻率波長波數傳播速度c=·光的波粒二象性不同波長的光具有不同的能量波長愈長，光的能量愈低；反之，則愈高粒子性E=h·=hc/3.2

分子光譜概述在分子內部除了電子運動外，還存在核間的相對運動，即核的振動和分子繞著重心的轉動。多數分子相應波長對應光區(qū)E電1~20eV60~1250nm紫外或可見光區(qū)內E振0.05~1eV25~1.25?紅外E轉小于0.05eV1.25cm~25?遠紅外E電＞E振＞E轉紅外光-分子振動和轉動能級躍遷；可應用于分子結構的研究物質對不同波長的光具有不同的吸收能力，物質也只能選擇性地吸收那些能量相當于該分子內部三種能量總合E的輻射光由于每種物質分子內部結構不同，能級千差萬別，決定了它們對不同波長光線的選擇性吸收物質對光的選擇性吸收分子的總能量E=E電+E振+E轉吸光度和透光度吸收光

反射光

透射光

I0=Ia

+It+Ir入射光

透光度T

——光透過的程度入射光I0透射光It

吸光度

A——物質分子對光的吸收程度T取值為0.0%~100.0%光全部吸收時光全部透射時3.3Lamber-Beer定律ItbLamber定律A∝bA∝cBeer定律Lamber-Beer定律：當一束平行單色光通過單一均勻的、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度以及液層厚度的乘積成正比。

A=kbc根據量子化理論:Lamber-Beer定律的推導E=h吸收過程就是光子被吸光質點(分子或離子)所俘獲，結果使吸光質點能量增加而處于激發(fā)狀態(tài)；俘獲光子的幾率與其面積有關如圖所示，假設有一束強度為I0的單色平行光，垂直通過一橫面積為s的均勻介質。當光強度為Ix的單色光通過吸收層(db)后，光強度減弱了dIx，則厚度為db的吸收層對光的吸收率為-dIx/Ix由于db為無限小，所以截面積上所有吸光質點所占的面積之和(ds)與橫截面積(s)之比(ds/s)可視為該截面積上光子被吸收的幾率，即：

-dIx/Ix=ds/s如果進一步在吸收介質里含有m種吸光質點，且它們之間沒有相互作用，設ai為第i種吸光質點對特定光子的吸收面積，dni為ds中第i種吸光質點的數目，則：

代入上式，得到:

當光束通過厚度為b的吸收層時，對上式兩邊積分，得到：

根據前述的吸光度A=lg(I0/It)定義，可得到:將式子中截面積s用均勻介質的體積V和光程b來表示，

即：s=V/b代入上式，得到

NA為Avogadro常數；ni/(NA?V)即為第i種質點在均勻介質中的濃度(ci)；將0.4343NAai合并為常數k，則：總吸光度等于吸收介質內各種吸光物質的吸光度之和，即吸光度具有加和性。這是進行多組分光度分析的理論基礎。A=kbc如果吸收介質內只有一種吸光物質時，公式可簡化為:比例常數的表示形式A=abcA：吸光度，描述溶液對光的吸收程度，無單位b：液層厚度(光程長度)，單位cmc：溶液的質量濃度，單位g·L-1k：質量吸收系數，單位L·g-1·cm-1

A=kbcA：吸光度，無單位b：液層厚度，單位cmc：溶液的摩爾濃度，單位mol·L-1ε：摩爾吸收系數，單位L·mol-1·cm-1

A=εbc當濃度為1moL·L-1，厚度為1cm時的溶液，在一定波長下測得的吸光度大小。摩爾吸收系數ε物理意義

ε與物質的性質、入射光波長、溫度有關

ε越大，方法的靈敏度越高鋼樣0.500g溶解后在容量瓶中配成100mL溶液。分取20.00mL該溶液于50mL容量瓶中，其中的Mn2+氧化成MnO4-后，稀釋定容。然后在λ=525nm處，用b=2cm的比色皿測得A=0.60。已知ε525=2.3×103L·mol-1·cm-1，計算鋼樣中Mn的質量分數(﹪)。Lamber-Beer定律的相關計算解：

試樣中錳的質量m=1.3×10-4×0.05×5×54.94=17.85×10-4g3.4光譜曲線表示方法波長吸光度吸收曲線標準曲線最大吸收波長max定性分析定量分析AA吸收曲線描述了物質對不同波長光的吸收能力大小，反映了物質分子能級的變化。吸收曲線形狀和max的位置以及吸收強度等與分子的結構密切相關。因此，利用吸收曲線可以對物質進行定性分析；而在某一波長下測得的吸光度與物質濃度的工作曲線可對物質進行定量分析。不同物質其吸收曲線的形狀和λmax各不相同。不同濃度的同一物質，

λmax不變，在吸收峰及附近處的吸光度隨濃度增加而增大。吸收曲線討論3.5

吸光度的測量吸光度A的測量不同濃度標準溶液的配置工作曲線(標準曲線)A=εbc光吸收定律發(fā)生偏離關于曲線不過原點的原因溶液中除了吸光物質吸收入射光以外，含有的其它試劑或離子也可能吸收入射光；另外，在測定過程中，部分光被器皿表面反射而會造成損失。克服方法通常將試液和空白液分別置于相同材料和厚度的比色皿中，此空白液即稱為參比溶液。調節(jié)儀器，使參比溶液的A=0，然后再測定其它溶液的A值。物理性因素——儀器的非理想性光吸收定律發(fā)生偏離的原因1非單色光引起的偏離

L-B定律適用于單色光，而分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。由于物質對不同波長光的吸收程度不同，結果導致曲線負偏離。A實=lg(I0+I0)/(It+It)

=lg(It·10bc+It·10bc)/(It+It)=lg10bc[It+It·10(-)bc]/(It+It)=bc+lg[It+It·10(-)bc]/(It+It)

=A理+A

由于，所以A為負值；A實A理，產生負偏。與的差值及濃度c愈大，則負值A愈大,對光吸收定律的偏離程度就愈嚴重。推導：

設一束入射光為含有兩個波長max、的復合光，兩個波長對應的入射光強度分別為I0和I0，透過光強度為It和It，總入射光強度I0總=I0+I0；總透過光強度It總=It+It；選擇吸收曲線的max作入射光波長。

因為吸收曲線峰值頂部曲線較平坦，入射光譜帶內各波長的值相近。選擇max，偏離光吸收定律較小。降低由于單色光不純造成負偏的方法?選擇高分辨率儀器，使入射光波長范圍盡可能窄。

只有當干擾物質存在并對待測物質的max產生吸收時，才選擇沒干擾的其它波長作入射光波長。光吸收定律發(fā)生偏離的原因2雜散光的影響

不包括在入射光帶內即不通過吸收池而直接進入檢測器的非單色光。來源：a.儀器內光學部件及機械零件反射和散射的光；b.外界及光源漏進檢測器的光；c.光學系統(tǒng)有缺陷而引起的不均勻散射等；雜散光一般引起負偏離。光吸收定律發(fā)生偏離的原因3溶液本身的原因溶液濃度的變化顯著改變溶液的折射率折射率n校正公式：A=bc·n/(n2+2)2一般在濃度小于0.01moL/L時，n基本上為常數，其影響可忽略不計，說明L-B定律適用于稀溶液。溶液若為膠體溶液、乳濁液或懸濁液時，在入射光通過溶液時，除一部分被吸光粒子吸收外，還有部分因散射而損失，使透光度減小，A實。所以往往發(fā)生正偏離。光吸收定律發(fā)生偏離的原因3化學性因素

吸光物質常因離解、締合而形成新化合物或互變異構等化學變化而改變其濃度，導致了偏離。例：P43

習題2,3,5作業(yè)3.6

分光光度法原理比較有色溶液(吸光物質)對某一波長的吸收情況特點采用棱鏡或光柵等分光元件獲得單色光儀器所用儀器稱為分光光度計，測量范圍不再局限于可見光區(qū)域內，可擴展至紫外和紅外光區(qū)域。分光光度計單光束分光光度計結構圖分光光度計主要部件及作用光源可見區(qū)光源常用鎢燈或碘鎢燈，發(fā)射波長約為320~2500nm紫外光源多為氣體放電光源，如氫、氘放電燈及汞燈等一般儀器上都設置有穩(wěn)壓電源，因為電源電壓的變化會引起光源發(fā)光強度的波動，從而影響測定結果。鎢燈氘燈將光源發(fā)出的連續(xù)光譜色散為單色光的裝置稱為單色器單色器利用光的色散原理制成單色器由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成單色器工作原理1可見分光光度計—玻璃石英—紫外分光光度計棱鏡單色器單色器工作原理2光柵單色器狹縫和透鏡調節(jié)光的強度，控制光的方向并獲得所需波長的單色光當復合光照射到光柵上時，根據光的衍射和干涉原理，色散為不同波長的單色光。吸收池玻璃—可見及紅外光區(qū)石英—紫外及紅外光區(qū)盛裝試液，決定液層厚度檢測器紫外-可見光信號電信號光電效應硒光電池硒光電池當照射光強度不大，且光電池外電路電阻小于100Ω時，光電流i=KI?？芍苯訙y量受強光照射或長時間連續(xù)使用，會產生疲勞現象，即光電流逐漸下降，i與I不成正比。內阻小，與一般直流放大器不相匹配；溫度系數較大，使用時要注意隔熱，防止光線直射。易受潮，受潮后光電流大小會不正常，甚至引起光電池完全失效。光電管光電管該電流的大小與照射到陰極上的光強度成正比光電管產生的光電流很小，需經放大后才能被測定。根據陰極光敏材料不同，光譜靈敏區(qū)可分為藍敏和紅敏兩種。前者在陰極表面沉積Sb-Cs，可用于波長210-625nm測定，后者在陰極表面沉積Ag-Cs2O-Cs，可用于波長625-1000nm測定。顯示系統(tǒng)其作用是將檢測器輸出的電信號以光吸收的形狀(A或T)顯示。常用的顯示測量儀器有電位計、檢流計、自動記錄儀及數字顯示裝置。3.7

顯色反應與顯色劑顯色反應：與待測離子反應生成對某波長有較大吸收的物質后再進行測定的反應。

顯色劑：加入的試劑

顯色反應：

M

+

R

→

MR

（待測組分）（顯色劑）（有吸收的物質）

功能化AuNPs與10種重金屬離子反應后的比色照片分光光度法對顯色反應的要求生成物應組成恒定，穩(wěn)定性好，顯色條件易于控制，保證測量結果有良好的重現性；對照性好，顯色劑與有色配合物兩者的max差別要在60nm以上。生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強的吸光能力，即吸收系數(一般指)較大；顯色反應的影響因素1顯色劑用量cR，AcR，AcR達到某一數值時

A值趨于平坦平坦部分較窄控制cR的量cR，A沒有較明顯的平坦用某個標準溶液作對比通過實驗確定溶液酸度溶液pH會影響顯色劑的平衡濃度和顏色影響待測金屬離子的存在狀態(tài)影響生成的配合物的組成pH值范圍配合物組成顏色＜4Fe(C7H4O3)+

紫紅色(1:1)4-7Fe(C7H4O3)2-

棕橙色(1:2)8-10Fe(C7H4O3)3-黃色(1:3)顯色反應的影響因素2顯色反應的影響因素3時間、溫度條件實驗確定干擾離子本身有顏色或與顯色劑生成有色配合物，A，正干擾；生成無色配合物，降低被測組分或顯色劑的濃度，A，負干擾。消除干擾離子控制溶液酸度加入掩蔽劑利用O-R反應，改變干擾離子的價態(tài)利用參比溶液消除顯色劑和某些干擾離子選取適當波長采用某種分離方法顯色劑無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機顯色劑：種類繁多，如偶氮類顯色劑、三苯甲烷類。生色團和助色團生色團吸收紫外-可見光的基團結構：具有不飽和鍵和未成對電子的基團例：C＝C；C＝O；C＝N；-N＝N-

助色團本身無紫外吸收，但可以使生色團吸收峰加強同時使吸收峰長移的基團。結構：含孤對電子，與生色團的不飽和鍵相互作用例：-OH；-OR；-NH-；-NR2-；-X紅移：在分子中引入的一些基團或受到其它外界因素影響，吸收峰向長波方向移動。紅移和藍移藍移：吸收峰向短波方向移動。三元配合物三元混配配合物適用于配位數較高，容易形成未飽和配合物的金屬離子離子締合物

與混配物不同的是金屬離子的配位數已經滿足，但電荷沒有飽和。一般離子締合物具有疏水性，主要應用于萃取分光光度測定。金屬離子-配合劑-表面活性劑體系如加入某些長鏈的季胺鹽、乳化劑等表面活性劑，可形成膠束化合物，吸收峰有明顯的波長紅移現象，顯著提高靈敏度。3.8

吸光光度法測量條件選擇光度測量誤差

∵A=-lgTT=100%，A=0T=10%，A=1.0T=0%，A=∞吸光光度讀數誤差A，讀數波動引起的誤差，因此選擇合適的吸光度范圍，可減小測量結果的誤差。是否存在最佳讀數范圍？何值時誤差最小？根據朗伯—比耳定律：A=-lgT=εbc吸光光度讀數范圍選擇要使測定結果(c/c)的相對誤差最小，對上式求導應有一極小值。即：得：A=-lgT=0.4343

或T=36.8%當透光度為15%~70%(吸光度0.2~0.8)時，濃度測量的相對偏差較??；此即分光光度分析中比較適宜的吸光度測量范圍。測量條件選擇入射光波長選擇——最大吸收原則有共存組分干擾時，入射波長的選擇原則是：

吸收最大；干擾最小無干擾，選擇max有干擾，B為干擾物，選擇1

例：用丁二酮肟顯色測定鋼中的鎳，其最大吸收波長在470nm左右；試樣中的鐵用酒石酸鉀掩蔽,在同樣波長下，也有吸收，對測定有干擾。

從圖可知，當波長大于500nm時，干擾變小，所以測定時，可將入射光波長選在500nm以上。雖然靈敏度有所降低，但可消除干擾。丁二酮肟鎳酒石酸鐵測量條件選擇控制適當的吸光度范圍A=bc(0.2-0.8)調節(jié)b值改變濃度c選擇適當的參比溶液I0It參比樣品儀器調零A參比=0A總=A參比+εbc=εbc參比溶液的選擇參比溶液——測量時用作比較的、不含待測物質但其基體盡可能與試樣溶液相似的溶液ABCDA:待測物質B:顯色劑及其他試劑C:樣品基體D:溶劑測定波長處：B、C、D無吸收，純溶劑D作參比液B略有吸收，C、D無吸收，“試劑空白”(B、D)作參比液C有吸收，B、D無吸收，“試樣空白”(C、D)作參比液B、C有吸收，則應在樣品溶液中加入適當的試劑，將被測物掩蔽起來，使之與顯色劑不再反應，B、C、D作參比液3.9

定量分析單組分的測定依據：A=εbc標準曲線法標準對比法(試樣溶液)(標準溶液)多組分測定多組分同時存在的測定依據：吸收曲線不重疊吸收曲線重疊普通分光光度法的不足問題A過大過小c過高過低讀數波動引起誤差變大原因空白和待測液A值相差大，A或T的讀數落在標尺的一端，造成讀數相對誤差大。試劑空白作參比，c偏高，T偏小，靈敏度差。差示分光光度法采用一個比待測溶液濃度稍低的標準溶液作為參比溶液cS標準溶液為參比，調節(jié)透光度為100%(A=0)，測量待測液吸光度，得到溶液(cX和cS)吸光度的差值。參比樣品儀器調零A參比=0A總=

Ax-As=εb(cx-cs)兩溶液透光度比值并未改變差示法中相當于把刻度讀數放大了10倍雙波長分光光度法顯色劑與待測物的吸收光譜重疊多組分試樣(性質相近與待測物的吸收光譜重疊)渾濁試樣背景吸收大的試樣(存在散射和特征吸收)雙波長分光光度法原理I0I0I1I2A=A2-A1=lgI1/I2=(2–1)bc特點：避免因試樣和參比兩個吸收池之間的差異所引入的誤差消除背景吸收及光散射所引起的誤差等吸收法吸收曲線部分重疊思考：測量波長和參比波長如何選擇A與cx成正比，與cy無關，即消除了組分Y的干擾。3.10

紫外吸收光譜法多數分子相應波長對應光區(qū)E電1~20eV60~1250nm紫外或可見光區(qū)內E振0.05~1eV25~1.25?紅外E轉小于0.05eV1.25cm~25?遠紅外分子中價電子躍遷產生，決定于價電子分布和結合光譜圖簡單，峰形寬，定性分析信號少共軛體系的定量分析，靈敏度高，檢出限低電子躍遷類型COHnpsHsp

*s*RKE,BnpE分子軌道理論成鍵分子軌道反鍵分子軌道非鍵軌道電子躍遷能量四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊

<π→π＊

≤

n→σ＊

<σ→σ＊

主要躍遷類型*所需能量高，一般發(fā)生在遠紫外區(qū)飽和烴中的C–C鍵屬于這類躍遷只能被真空紫外分光光度計檢測到作為溶劑使用例：甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm主要躍遷類型n*吸收波長為150～250nm含非鍵電子的飽和烴衍生物易產生此類躍遷含溴、碘、硫和氮的化合物吸收峰>200nm含氟、氯、氧的化合物吸收峰<200nm化合物λmax(nm)H2O167CH3I258CH3NH2215主要躍遷類型π→π*吸收波長遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)εmax一般在104L·mol-1·cm-1以上，屬于強吸收單一烯烴

乙烯λmax162

nm共軛烯烴

芳香烴化合物λmax(nm)εmax

(L·mol-1·cm-1)苯254200甲苯261300間二甲苯263300苯的紫外吸收光譜主要躍遷類型n→π*一般在由雜原子直接構成π鍵的基團中，如-C=O及-C=N躍遷能量最小，λmax最長，吸收強度弱，

ε<100π－π*、n－π*躍遷在分析上最有價值有機化合物的紫外吸收光譜飽和烴及其取代衍生物飽和烴類化合物只含鍵。因此只產生*躍遷吸收波長在150nm真空紫外區(qū)，超出一般儀器測量范圍常用