第二章紫外-可見分光光度法

第2章紫外-可見分光光度法吸光光度法基本原理光度計(jì)及其基本部件顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇吸光度測量條件的選擇3.1

概述吸光光度法——基于物質(zhì)對光的選擇性吸收的分析方法比色法比較有色溶液對溶液透過光的強(qiáng)度可見分光光度法紫外分光光度法CuSO4溶液KMnO4溶液為什么這些溶液呈現(xiàn)不同的顏色？Fe3＋＋SCN－→[Fe(SCN)]2＋比較有色溶液對某一波長光的吸收物質(zhì)顏色與吸收光顏色的互補(bǔ)關(guān)系/nm吸收光顏色400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠

當(dāng)λ＝200－400nm:（近）紫外區(qū)，紫外分（吸）光光度法

λ＝400－750nm:

可見光區(qū)，可見分（吸）光光度法電磁輻射波動性周期T頻率波長波數(shù)傳播速度c=·光的波粒二象性不同波長的光具有不同的能量波長愈長，光的能量愈低；反之，則愈高粒子性E=h·=hc/3.2

分子光譜概述在分子內(nèi)部除了電子運(yùn)動外，還存在核間的相對運(yùn)動，即核的振動和分子繞著重心的轉(zhuǎn)動。多數(shù)分子相應(yīng)波長對應(yīng)光區(qū)E電1~20eV60~1250nm紫外或可見光區(qū)內(nèi)E振0.05~1eV25~1.25?紅外E轉(zhuǎn)小于0.05eV1.25cm~25?遠(yuǎn)紅外E電＞E振＞E轉(zhuǎn)紅外光-分子振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷；可應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)的研究物質(zhì)對不同波長的光具有不同的吸收能力，物質(zhì)也只能選擇性地吸收那些能量相當(dāng)于該分子內(nèi)部三種能量總合E的輻射光由于每種物質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，能級千差萬別，決定了它們對不同波長光線的選擇性吸收物質(zhì)對光的選擇性吸收分子的總能量E=E電+E振+E轉(zhuǎn)吸光度和透光度吸收光

反射光

透射光

I0=Ia

+It+Ir入射光

透光度T

——光透過的程度入射光I0透射光It

吸光度

A——物質(zhì)分子對光的吸收程度T取值為0.0%~100.0%光全部吸收時(shí)光全部透射時(shí)3.3Lamber-Beer定律ItbLamber定律A∝bA∝cBeer定律Lamber-Beer定律：當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻的、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度以及液層厚度的乘積成正比。

A=kbc根據(jù)量子化理論:Lamber-Beer定律的推導(dǎo)E=h吸收過程就是光子被吸光質(zhì)點(diǎn)(分子或離子)所俘獲，結(jié)果使吸光質(zhì)點(diǎn)能量增加而處于激發(fā)狀態(tài)；俘獲光子的幾率與其面積有關(guān)如圖所示，假設(shè)有一束強(qiáng)度為I0的單色平行光，垂直通過一橫面積為s的均勻介質(zhì)。當(dāng)光強(qiáng)度為Ix的單色光通過吸收層(db)后，光強(qiáng)度減弱了dIx，則厚度為db的吸收層對光的吸收率為-dIx/Ix由于db為無限小，所以截面積上所有吸光質(zhì)點(diǎn)所占的面積之和(ds)與橫截面積(s)之比(ds/s)可視為該截面積上光子被吸收的幾率，即：

-dIx/Ix=ds/s如果進(jìn)一步在吸收介質(zhì)里含有m種吸光質(zhì)點(diǎn)，且它們之間沒有相互作用，設(shè)ai為第i種吸光質(zhì)點(diǎn)對特定光子的吸收面積，dni為ds中第i種吸光質(zhì)點(diǎn)的數(shù)目，則：

代入上式，得到:

當(dāng)光束通過厚度為b的吸收層時(shí)，對上式兩邊積分，得到：

根據(jù)前述的吸光度A=lg(I0/It)定義，可得到:將式子中截面積s用均勻介質(zhì)的體積V和光程b來表示，

即：s=V/b代入上式，得到

NA為Avogadro常數(shù)；ni/(NA?V)即為第i種質(zhì)點(diǎn)在均勻介質(zhì)中的濃度(ci)；將0.4343NAai合并為常數(shù)k，則：總吸光度等于吸收介質(zhì)內(nèi)各種吸光物質(zhì)的吸光度之和，即吸光度具有加和性。這是進(jìn)行多組分光度分析的理論基礎(chǔ)。A=kbc如果吸收介質(zhì)內(nèi)只有一種吸光物質(zhì)時(shí)，公式可簡化為:比例常數(shù)的表示形式A=abcA：吸光度，描述溶液對光的吸收程度，無單位b：液層厚度(光程長度)，單位cmc：溶液的質(zhì)量濃度，單位g·L-1k：質(zhì)量吸收系數(shù)，單位L·g-1·cm-1

A=kbcA：吸光度，無單位b：液層厚度，單位cmc：溶液的摩爾濃度，單位mol·L-1ε：摩爾吸收系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1

A=εbc當(dāng)濃度為1moL·L-1，厚度為1cm時(shí)的溶液，在一定波長下測得的吸光度大小。摩爾吸收系數(shù)ε物理意義

ε與物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溫度有關(guān)

ε越大，方法的靈敏度越高鋼樣0.500g溶解后在容量瓶中配成100mL溶液。分取20.00mL該溶液于50mL容量瓶中，其中的Mn2+氧化成MnO4-后，稀釋定容。然后在λ=525nm處，用b=2cm的比色皿測得A=0.60。已知ε525=2.3×103L·mol-1·cm-1，計(jì)算鋼樣中Mn的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(﹪)。Lamber-Beer定律的相關(guān)計(jì)算解：

試樣中錳的質(zhì)量m=1.3×10-4×0.05×5×54.94=17.85×10-4g3.4光譜曲線表示方法波長吸光度吸收曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸收波長max定性分析定量分析AA吸收曲線描述了物質(zhì)對不同波長光的吸收能力大小，反映了物質(zhì)分子能級的變化。吸收曲線形狀和max的位置以及吸收強(qiáng)度等與分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此，利用吸收曲線可以對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；而在某一波長下測得的吸光度與物質(zhì)濃度的工作曲線可對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。不同物質(zhì)其吸收曲線的形狀和λmax各不相同。不同濃度的同一物質(zhì)，

λmax不變，在吸收峰及附近處的吸光度隨濃度增加而增大。吸收曲線討論3.5

吸光度的測量吸光度A的測量不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置工作曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)A=εbc光吸收定律發(fā)生偏離關(guān)于曲線不過原點(diǎn)的原因溶液中除了吸光物質(zhì)吸收入射光以外，含有的其它試劑或離子也可能吸收入射光；另外，在測定過程中，部分光被器皿表面反射而會造成損失?？朔椒ㄍǔ⒃囈汉涂瞻滓悍謩e置于相同材料和厚度的比色皿中，此空白液即稱為參比溶液。調(diào)節(jié)儀器，使參比溶液的A=0，然后再測定其它溶液的A值。物理性因素——儀器的非理想性光吸收定律發(fā)生偏離的原因1非單色光引起的偏離

L-B定律適用于單色光，而分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，結(jié)果導(dǎo)致曲線負(fù)偏離。A實(shí)=lg(I0+I0)/(It+It)

=lg(It·10bc+It·10bc)/(It+It)=lg10bc[It+It·10(-)bc]/(It+It)=bc+lg[It+It·10(-)bc]/(It+It)

=A理+A

由于，所以A為負(fù)值；A實(shí)A理，產(chǎn)生負(fù)偏。與的差值及濃度c愈大，則負(fù)值A(chǔ)愈大,對光吸收定律的偏離程度就愈嚴(yán)重。推導(dǎo)：

設(shè)一束入射光為含有兩個(gè)波長max、的復(fù)合光，兩個(gè)波長對應(yīng)的入射光強(qiáng)度分別為I0和I0，透過光強(qiáng)度為It和It，總?cè)肷涔鈴?qiáng)度I0總=I0+I0；總透過光強(qiáng)度It總=It+It；選擇吸收曲線的max作入射光波長。

因?yàn)槲涨€峰值頂部曲線較平坦，入射光譜帶內(nèi)各波長的值相近。選擇max，偏離光吸收定律較小。降低由于單色光不純造成負(fù)偏的方法?選擇高分辨率儀器，使入射光波長范圍盡可能窄。

只有當(dāng)干擾物質(zhì)存在并對待測物質(zhì)的max產(chǎn)生吸收時(shí)，才選擇沒干擾的其它波長作入射光波長。光吸收定律發(fā)生偏離的原因2雜散光的影響

不包括在入射光帶內(nèi)即不通過吸收池而直接進(jìn)入檢測器的非單色光。來源：a.儀器內(nèi)光學(xué)部件及機(jī)械零件反射和散射的光；b.外界及光源漏進(jìn)檢測器的光；c.光學(xué)系統(tǒng)有缺陷而引起的不均勻散射等；雜散光一般引起負(fù)偏離。光吸收定律發(fā)生偏離的原因3溶液本身的原因溶液濃度的變化顯著改變?nèi)芤旱恼凵渎收凵渎蕁校正公式：A=bc·n/(n2+2)2一般在濃度小于0.01moL/L時(shí)，n基本上為常數(shù)，其影響可忽略不計(jì)，說明L-B定律適用于稀溶液。溶液若為膠體溶液、乳濁液或懸濁液時(shí)，在入射光通過溶液時(shí)，除一部分被吸光粒子吸收外，還有部分因散射而損失，使透光度減小，A實(shí)。所以往往發(fā)生正偏離。光吸收定律發(fā)生偏離的原因3化學(xué)性因素

吸光物質(zhì)常因離解、締合而形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，導(dǎo)致了偏離。例：P43

習(xí)題2,3,5作業(yè)3.6

分光光度法原理比較有色溶液(吸光物質(zhì))對某一波長的吸收情況特點(diǎn)采用棱鏡或光柵等分光元件獲得單色光儀器所用儀器稱為分光光度計(jì)，測量范圍不再局限于可見光區(qū)域內(nèi)，可擴(kuò)展至紫外和紅外光區(qū)域。分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)圖分光光度計(jì)主要部件及作用光源可見區(qū)光源常用鎢燈或碘鎢燈，發(fā)射波長約為320~2500nm紫外光源多為氣體放電光源，如氫、氘放電燈及汞燈等一般儀器上都設(shè)置有穩(wěn)壓電源，因?yàn)殡娫措妷旱淖兓瘯鸸庠窗l(fā)光強(qiáng)度的波動，從而影響測定結(jié)果。鎢燈氘燈將光源發(fā)出的連續(xù)光譜色散為單色光的裝置稱為單色器單色器利用光的色散原理制成單色器由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成單色器工作原理1可見分光光度計(jì)—玻璃石英—紫外分光光度計(jì)棱鏡單色器單色器工作原理2光柵單色器狹縫和透鏡調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度，控制光的方向并獲得所需波長的單色光當(dāng)復(fù)合光照射到光柵上時(shí)，根據(jù)光的衍射和干涉原理，色散為不同波長的單色光。吸收池玻璃—可見及紅外光區(qū)石英—紫外及紅外光區(qū)盛裝試液，決定液層厚度檢測器紫外-可見光信號電信號光電效應(yīng)硒光電池硒光電池當(dāng)照射光強(qiáng)度不大，且光電池外電路電阻小于100Ω時(shí)，光電流i=KI。可直接測量受強(qiáng)光照射或長時(shí)間連續(xù)使用，會產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，即光電流逐漸下降，i與I不成正比。內(nèi)阻小，與一般直流放大器不相匹配；溫度系數(shù)較大，使用時(shí)要注意隔熱，防止光線直射。易受潮，受潮后光電流大小會不正常，甚至引起光電池完全失效。光電管光電管該電流的大小與照射到陰極上的光強(qiáng)度成正比光電管產(chǎn)生的光電流很小，需經(jīng)放大后才能被測定。根據(jù)陰極光敏材料不同，光譜靈敏區(qū)可分為藍(lán)敏和紅敏兩種。前者在陰極表面沉積Sb-Cs，可用于波長210-625nm測定，后者在陰極表面沉積Ag-Cs2O-Cs，可用于波長625-1000nm測定。顯示系統(tǒng)其作用是將檢測器輸出的電信號以光吸收的形狀(A或T)顯示。常用的顯示測量儀器有電位計(jì)、檢流計(jì)、自動記錄儀及數(shù)字顯示裝置。3.7

顯色反應(yīng)與顯色劑顯色反應(yīng)：與待測離子反應(yīng)生成對某波長有較大吸收的物質(zhì)后再進(jìn)行測定的反應(yīng)。

顯色劑：加入的試劑

顯色反應(yīng)：

M

+

R

→

MR

（待測組分）（顯色劑）（有吸收的物質(zhì)）

功能化AuNPs與10種重金屬離子反應(yīng)后的比色照片分光光度法對顯色反應(yīng)的要求生成物應(yīng)組成恒定，穩(wěn)定性好，顯色條件易于控制，保證測量結(jié)果有良好的重現(xiàn)性；對照性好，顯色劑與有色配合物兩者的max差別要在60nm以上。生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸光能力，即吸收系數(shù)(一般指)較大；顯色反應(yīng)的影響因素1顯色劑用量cR，AcR，AcR達(dá)到某一數(shù)值時(shí)

A值趨于平坦平坦部分較窄控制cR的量cR，A沒有較明顯的平坦用某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液作對比通過實(shí)驗(yàn)確定溶液酸度溶液pH會影響顯色劑的平衡濃度和顏色影響待測金屬離子的存在狀態(tài)影響生成的配合物的組成pH值范圍配合物組成顏色＜4Fe(C7H4O3)+

紫紅色(1:1)4-7Fe(C7H4O3)2-

棕橙色(1:2)8-10Fe(C7H4O3)3-黃色(1:3)顯色反應(yīng)的影響因素2顯色反應(yīng)的影響因素3時(shí)間、溫度條件實(shí)驗(yàn)確定干擾離子本身有顏色或與顯色劑生成有色配合物，A，正干擾；生成無色配合物，降低被測組分或顯色劑的濃度，A，負(fù)干擾。消除干擾離子控制溶液酸度加入掩蔽劑利用O-R反應(yīng)，改變干擾離子的價(jià)態(tài)利用參比溶液消除顯色劑和某些干擾離子選取適當(dāng)波長采用某種分離方法顯色劑無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機(jī)顯色劑：種類繁多，如偶氮類顯色劑、三苯甲烷類。生色團(tuán)和助色團(tuán)生色團(tuán)吸收紫外-可見光的基團(tuán)結(jié)構(gòu)：具有不飽和鍵和未成對電子的基團(tuán)例：C＝C；C＝O；C＝N；-N＝N-

助色團(tuán)本身無紫外吸收，但可以使生色團(tuán)吸收峰加強(qiáng)同時(shí)使吸收峰長移的基團(tuán)。結(jié)構(gòu)：含孤對電子，與生色團(tuán)的不飽和鍵相互作用例：-OH；-OR；-NH-；-NR2-；-X紅移：在分子中引入的一些基團(tuán)或受到其它外界因素影響，吸收峰向長波方向移動。紅移和藍(lán)移藍(lán)移：吸收峰向短波方向移動。三元配合物三元混配配合物適用于配位數(shù)較高，容易形成未飽和配合物的金屬離子離子締合物

與混配物不同的是金屬離子的配位數(shù)已經(jīng)滿足，但電荷沒有飽和。一般離子締合物具有疏水性，主要應(yīng)用于萃取分光光度測定。金屬離子-配合劑-表面活性劑體系如加入某些長鏈的季胺鹽、乳化劑等表面活性劑，可形成膠束化合物，吸收峰有明顯的波長紅移現(xiàn)象，顯著提高靈敏度。3.8

吸光光度法測量條件選擇光度測量誤差

∵A=-lgTT=100%，A=0T=10%，A=1.0T=0%，A=∞吸光光度讀數(shù)誤差A(yù)，讀數(shù)波動引起的誤差，因此選擇合適的吸光度范圍，可減小測量結(jié)果的誤差。是否存在最佳讀數(shù)范圍？何值時(shí)誤差最?。扛鶕?jù)朗伯—比耳定律：A=-lgT=εbc吸光光度讀數(shù)范圍選擇要使測定結(jié)果(c/c)的相對誤差最小，對上式求導(dǎo)應(yīng)有一極小值。即：得：A=-lgT=0.4343

或T=36.8%當(dāng)透光度為15%~70%(吸光度0.2~0.8)時(shí)，濃度測量的相對偏差較??；此即分光光度分析中比較適宜的吸光度測量范圍。測量條件選擇入射光波長選擇——最大吸收原則有共存組分干擾時(shí)，入射波長的選擇原則是：

吸收最大；干擾最小無干擾，選擇max有干擾，B為干擾物，選擇1

例：用丁二酮肟顯色測定鋼中的鎳，其最大吸收波長在470nm左右；試樣中的鐵用酒石酸鉀掩蔽,在同樣波長下，也有吸收，對測定有干擾。

從圖可知，當(dāng)波長大于500nm時(shí)，干擾變小，所以測定時(shí)，可將入射光波長選在500nm以上。雖然靈敏度有所降低，但可消除干擾。丁二酮肟鎳酒石酸鐵測量條件選擇控制適當(dāng)?shù)奈舛确秶鶤=bc(0.2-0.8)調(diào)節(jié)b值改變濃度c選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤篒0It參比樣品儀器調(diào)零A參比=0A總=A參比+εbc=εbc參比溶液的選擇參比溶液——測量時(shí)用作比較的、不含待測物質(zhì)但其基體盡可能與試樣溶液相似的溶液ABCDA:待測物質(zhì)B:顯色劑及其他試劑C:樣品基體D:溶劑測定波長處：B、C、D無吸收，純?nèi)軇〥作參比液B略有吸收，C、D無吸收，“試劑空白”(B、D)作參比液C有吸收，B、D無吸收，“試樣空白”(C、D)作參比液B、C有吸收，則應(yīng)在樣品溶液中加入適當(dāng)?shù)脑噭瑢⒈粶y物掩蔽起來，使之與顯色劑不再反應(yīng)，B、C、D作參比液3.9

定量分析單組分的測定依據(jù)：A=εbc標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)對比法(試樣溶液)(標(biāo)準(zhǔn)溶液)多組分測定多組分同時(shí)存在的測定依據(jù)：吸收曲線不重疊吸收曲線重疊普通分光光度法的不足問題A過大過小c過高過低讀數(shù)波動引起誤差變大原因空白和待測液A值相差大，A或T的讀數(shù)落在標(biāo)尺的一端，造成讀數(shù)相對誤差大。試劑空白作參比，c偏高，T偏小，靈敏度差。差示分光光度法采用一個(gè)比待測溶液濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液cS標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，調(diào)節(jié)透光度為100%(A=0)，測量待測液吸光度，得到溶液(cX和cS)吸光度的差值。參比樣品儀器調(diào)零A參比=0A總=

Ax-As=εb(cx-cs)兩溶液透光度比值并未改變差示法中相當(dāng)于把刻度讀數(shù)放大了10倍雙波長分光光度法顯色劑與待測物的吸收光譜重疊多組分試樣(性質(zhì)相近與待測物的吸收光譜重疊)渾濁試樣背景吸收大的試樣(存在散射和特征吸收)雙波長分光光度法原理I0I0I1I2A=A2-A1=lgI1/I2=(2–1)bc特點(diǎn)：避免因試樣和參比兩個(gè)吸收池之間的差異所引入的誤差消除背景吸收及光散射所引起的誤差等吸收法吸收曲線部分重疊思考：測量波長和參比波長如何選擇A與cx成正比，與cy無關(guān)，即消除了組分Y的干擾。3.10

紫外吸收光譜法多數(shù)分子相應(yīng)波長對應(yīng)光區(qū)E電1~20eV60~1250nm紫外或可見光區(qū)內(nèi)E振0.05~1eV25~1.25?紅外E轉(zhuǎn)小于0.05eV1.25cm~25?遠(yuǎn)紅外分子中價(jià)電子躍遷產(chǎn)生，決定于價(jià)電子分布和結(jié)合光譜圖簡單，峰形寬，定性分析信號少共軛體系的定量分析，靈敏度高，檢出限低電子躍遷類型COHnpsHsp

*s*RKE,BnpE分子軌道理論成鍵分子軌道反鍵分子軌道非鍵軌道電子躍遷能量四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序?yàn)椋簄→π＊

<π→π＊

≤

n→σ＊

<σ→σ＊

主要躍遷類型*所需能量高，一般發(fā)生在遠(yuǎn)紫外區(qū)飽和烴中的C–C鍵屬于這類躍遷只能被真空紫外分光光度計(jì)檢測到作為溶劑使用例：甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm主要躍遷類型n*吸收波長為150～250nm含非鍵電子的飽和烴衍生物易產(chǎn)生此類躍遷含溴、碘、硫和氮的化合物吸收峰>200nm含氟、氯、氧的化合物吸收峰<200nm化合物λmax(nm)H2O167CH3I258CH3NH2215主要躍遷類型π→π*吸收波長遠(yuǎn)紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)εmax一般在104L·mol-1·cm-1以上，屬于強(qiáng)吸收單一烯烴

乙烯λmax162

nm共軛烯烴

芳香烴化合物λmax(nm)εmax

(L·mol-1·cm-1)苯254200甲苯261300間二甲苯263300苯的紫外吸收光譜主要躍遷類型n→π*一般在由雜原子直接構(gòu)成π鍵的基團(tuán)中，如-C=O及-C=N躍遷能量最小，λmax最長，吸收強(qiáng)度弱，

ε<100π－π*、n－π*躍遷在分析上最有價(jià)值有機(jī)化合物的紫外吸收光譜飽和烴及其取代衍生物飽和烴類化合物只含鍵。因此只產(chǎn)生*躍遷吸收波長在150nm真空紫外區(qū)，超出一般儀器測量范圍常用