復旦大學化學AII第十章液相色譜

第21章液相色譜分析法2023/2/3一.HPLC與GC的區(qū)別流動相分別為液體和氣體：擴散系數(shù)Dm液/Dm氣=10-5

速率方程H=A+B/v+CvA（渦流擴散項）∝dpB（分子擴散項）忽略不計C（傳質阻力項）∝dp2v∝1/dp2023/2/3填充柱氣相色譜柱，填料尺為80-100目(2毫米);高效液相色譜的固定相粒度在2－10微米,因此需要很高的反壓。高效液相色譜（HPLC）又稱為：高速液相HSLC高壓液相HPLC

高分辨液相HRLC2023/2/3HPLCGC分析對象70%-80%化合物20-30%氣體和無機、有機流動相液體（與組分有作用）氣體（化學惰性）柱溫低溫、室溫高溫流動相產(chǎn)生高壓泵+貯液瓶高壓鋼瓶進樣進樣器直接進樣柱形直型螺旋型載體粒子2－10um2mm柱長10cm-25cm＞1m高壓液相色譜與氣相色譜的比較2023/2/32023/2/3二.高效液相色譜法的特點

featureofHPLC

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2023/2/3三.液相色譜類型

固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等。

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

吸附色譜對中等分子量的油溶性樣品可獲得最佳的分離，適用于異構體分離和同系物分離；而對強極性或離子型的樣品，有時會發(fā)生不可逆吸附，不能得到滿意的結果。

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；1.液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography2023/2/31.被測組分性質（極性大?。?/p>

烴＜--------＜羧酸，醇2.吸附劑的活性：吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強

強極性物質——選擇弱吸附劑（固體固定相）弱極性物質——選擇強吸附劑（固體固定相）3.流動相的選擇：“相似相溶”原則

基本原則是極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。

吸附劑和流動相的選擇：

依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質2023/2/3極性吸附劑上有機化合物的保留順序如下（極性強保留時間長）：氟碳化合物<飽和烴<烯烴<芳烴<有機鹵化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸2023/2/32.液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：

正相色譜(normalphase)：流動相極性比固定相極性小反相色譜(reversephase)：流動相極性比固定相極性大

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2023/2/3液固色譜的固定相與氣固色譜的相類似，但粒子更小。液液色譜的固定相：化學鍵合的固定相——載體+固定液(1).固定相的載體a、硅膠⑴無定形全多孔硅膠YWG⑵球形全多孔硅膠YQG⑶堆積硅珠YQG

b、高分子多孔微球YSG(1).液液色譜的固定相2023/2/3(2).固定相的化學鍵合化學鍵合固定相:目前應用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/2/3(3).化學鍵合固定相的特點（1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快；（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2023/2/3(4).正相鍵合相色譜法的分離條件固定相：極性鍵合相，如氨基、氰基適應對象：極性化合物，如氨基、氰基、糖類多官能團化合物流動相：烷烴加適量極性調節(jié)劑（二氯甲烷＋甲醇）

出峰次序：極性小先出峰2023/2/3(5).反相鍵合相色譜法的分離條件固定相：非極性鍵合相如ODS適應對象：非極性或極性分子型的化合物，如短鏈烷和苯基化合物流動相：極性最強的水作基礎溶劑，加入甲醇、乙腈、四氫呋喃等極性調節(jié)劑

出峰次序：極性大先出峰

2023/2/3（6）、正反相鍵合相色譜法的比較反相鍵合相正相鍵合相固定相非極性如十八烷基鍵合相（ODS）極性如氨基、氰基鍵合相流動相極性（甲醇-水、乙腈-水）非極性（烷烴+適量極性調整劑）分離機制疏溶劑理論范德華力流動相極性與k的關系流動相極性越大，洗脫能力越小，則k越大，tR越大流動相極性越大，洗脫能力越大，k、tR均越小組分出峰順序極性大先出峰極性大后出峰應用非極性至中等極性極性化合物2023/2/3(7).液液色譜法的流動相(a).基本要求：1、不與固定相發(fā)生化學反應2、對樣品有適宜溶解力3、必須與檢測器相適應——如紫外4、粘度小5、沸點適中6、色譜純7、避免會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑（pH2-8）2023/2/3(b).流動相分類

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。2023/2/3(c).流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。反相液-液分配分離，也可類似操作。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/3四、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2023/2/3液相色譜儀（2）2023/2/3液相色譜儀（3）2023/2/3液相色譜儀（4）2023/2/31、主要部件

MainassemblyofHPLC(1).流程2023/2/3(2).液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。特點：

靈敏度高:10-10g/ml線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2023/2/3光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2023/2/32023/2/3光電二極管陣列檢測器2023/2/3b.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低(10-7g/ml)、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉式、反射式和干涉型三種；2023/2/3示差折光檢測器2023/2/3c.熒光檢測器

（fluorescencedetector）高靈敏度(10-12g/ml)、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；2023/2/3(3).高壓輸液泵主要部件之一，壓力：20-80大氣壓。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性2023/2/3氣相色譜分離條件：1.柱溫；2.氣體壓力、流速程序升溫2023/2/3(4).梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/2/3(5).進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：2023/2/3(6).高效分離柱