離心機-研究生10

分離分析儀器

離心機(centrifuge)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉蕓1內(nèi)容提綱一、離心機的工作原理二、常用的離心方法三、離心機的分類與結(jié)構(gòu)四、離心機的使用和維護五、離心方法的進展2

離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降現(xiàn)象。引言應(yīng)用離心沉降進行物質(zhì)的分析和分離的技術(shù)就稱為離心技術(shù)。實現(xiàn)離心技術(shù)的儀器是離心機(centrifuge)。3引言

生物學(xué)領(lǐng)域：分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無機物、有機物。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：主要用于分離、純化細胞、病毒、蛋白質(zhì)、酶和核酸。離心技術(shù)應(yīng)用很廣，在生命科學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)的各個領(lǐng)域都有相應(yīng)的使用。4第一節(jié)

離心機的工作原理5一、圓周運動與離心現(xiàn)象向心力：做圓周運動的物體所受的外力的合力。它的大小取決于外力的大小，方向是與速度的方向垂直，指向圓心。v:線速度;ω:旋轉(zhuǎn)角速度(弧度／秒);r:旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離(cm);m:顆粒質(zhì)量;ρ:物體密度;V:物體體積F=mv2/r=mrω2=ρVrω26離心現(xiàn)象：物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象，也叫離心運動。一、圓周運動與離心現(xiàn)象當(dāng)物體所受外力小于圓周運動所需要的向心力時，物體將向遠離圓心的方向運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。78二、液體中的微粒在重力場中的分離顆粒靜置一段時間后，受重力場影響會開始沉降運動。粒子越重，下沉越快。反之密度比液體小的粒子就會上浮，這個現(xiàn)象為重力沉降。沉降速度(sedimentationvelocity)：微粒在重力場中下降的速度。它的影響因素：微粒的大小、形態(tài)、密度、液體的粘度和重力場的強度。如實驗室制備血清時就可以采用室溫靜置的方法得到。9如果重力場的強度(g)足夠大，則沉降速度足夠快，那么就可以實現(xiàn)生物大分子的分離。擴散現(xiàn)象：

重力場中擴散現(xiàn)象是無條件的，絕對的。特別是對于病毒和蛋白質(zhì)類小分子物質(zhì)，擴散對物質(zhì)的沉降影響更大。如何克服？二、液體中的微粒在重力場中的分離10三、液體中的微粒在離心力場中的沉降顆粒在圓周運動時的切線運動稱為離心沉降。

實際上，顆粒在介質(zhì)中作切線運動時，將受到介質(zhì)的摩擦阻力，使顆粒在離心管中作曲線運動。11三、液體中的微粒在離心力場中的沉降顆粒在離心管中的沉降速度與離心機轉(zhuǎn)速有關(guān)，旋轉(zhuǎn)速度越快，顆粒沉降越快。mω2r=m(2πN/60)2r=4π2N2rm/3600m:顆粒質(zhì)量;ω:旋轉(zhuǎn)角速度；N:每分鐘轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)次數(shù)；r:離心半徑12相對離心力場是離心力場與重力場的比值，即R.C.F.的值表示離心力場相對于多少個g。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降通常為了使離心力場和重力場相比較，提出了相對離心力場（簡稱R.C.F）的概念。R.C.F.=mω2r/mg=ω2r/g13

相對離心力（RCF，Relativecentrifugalforce）是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。例如25000×g，則表示相對離心力為25000。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降相對離心力RCF的值（g值）取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（rpm）和旋轉(zhuǎn)半徑（r,以mm計算），可用如下公式表示（rpm：revolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min）

14由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降rav=(rmin＋rmax)/2但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺離心機的離心管，從管口至管底的各點與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“rav”代替：15一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。計算顆粒的相對離心力時，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報告超離心條件時，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化?？萍嘉墨I中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFav），即離心管中點的離心力。三、液體中的微粒在離心力場中的沉降16此外，根據(jù)RCF值（g值）、rpm值和r值之間的關(guān)系，可以從圖A圖B中大致讀出各種數(shù)值。17三、液體中的微粒在離心力場中的沉降由于轉(zhuǎn)頭的形狀和設(shè)計，離心管中從管頂至管底各點到旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的，為了計算相對離心力的數(shù)值可用平均相對離心力來表示，即同一離心轉(zhuǎn)頭部和底部所受離心力的平均值。離心機常有多種不同形狀的轉(zhuǎn)頭，其各自所反映的離心力場的大小和離心沉降距離也不一樣，在實際工作中應(yīng)根據(jù)分離要求正確選擇使用。18四、沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient):是指單位離心力場中樣品的沉降速度。它與樣品的質(zhì)量和密度成正比。名稱沉降系數(shù)（S）R.C.F.（g）轉(zhuǎn)速（r/min）細胞>107<200<1500細胞核4x106~107600~8003000線粒體2~7x10470007000微粒體102~1.5x1041x10530000DNA10~1202x10540000RNA4~504x10560000蛋白質(zhì)2~25>4x105>6000019第二節(jié)

常用的離心方法20一、分類制備離心方法：差速離心法密度梯度離心法分析離心方法：沉降速度法沉降平衡法等密度區(qū)帶分析離心法21二、差速離心法(differentialcentrifugation)差速離心法(differentialcentrifugationmethod)：是利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同(S)而進行分離，又稱差分離心或差級離心。22

特點介質(zhì)的密度均一；速度由低向高，逐級離心；分辨率不高。二、差速離心法(differentialcentrifugation)通常兩個組分的沉降系數(shù)差在10倍以上。分離大小相差懸殊的細胞和細胞器，僅僅適合粗提或者樣品濃縮。23對分離的細胞而言，沉降順序依次：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體。24

優(yōu)點：樣品處理量較大，可用于大量樣品的初級分離。

缺點：分離復(fù)雜樣品和要求分離純度要求較高時，離心次數(shù)太多，操作繁雜。25差速離心形成的沉淀（肝臟）沉淀RCF(gav)×?xí)r間內(nèi)容物P11000g×10min細胞核，重線粒體，大片細胞膜P23000g×10min重線粒體，細胞膜碎片P36000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，完整高爾基體P410000g×10min線粒體，溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體P520000g×10min溶酶體，過氧化物酶體，高爾基體膜，大的高密度小泡（如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）P6100000g×10min從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而來的所有小泡，細胞膜，高爾基體，核內(nèi)體等例注：RCF即相對離心力。26二、密度梯度離心(isodensitycentrifugation)密度梯度離心(isodensitycentrifugation)：又稱為區(qū)帶離心，是將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。27按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為兩種類型：

二、密度梯度離心(isodensitycentrifugation)分類速率區(qū)帶離心法（連續(xù)密度梯度離心法)

等密度離心法（不連續(xù)密度梯度離心法）

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速率區(qū)帶離心法是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同體積尺寸大小和不同沉降系數(shù)進行分離。

等密度區(qū)帶離心法是根據(jù)樣品組分的密度差別進行分離純化。29①分離效果好，可一次獲得較純顆粒。②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒。③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?。

優(yōu)點二、密度梯度離心

(isodensitycentrifugation)常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。30（1）速率區(qū)帶離心法

(velocitysedimentation)原理根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度（s)不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層向下沉降最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結(jié)束。31分離密度相近而沉降速度不等的細胞或細胞器。用途（1）速率區(qū)帶離心法

(velocitysedimentation)操作注意事項先在離心管中裝入密度梯度介質(zhì)。然后將預(yù)分離樣品混入一起離心。梯度液在離心過程中及離心完畢應(yīng)該避免因為震動而引起的粒子再混合。離心的時間要嚴(yán)格控制，如果時間過長，所有樣品可能全部到達離心管的底部；離心時間不足，樣品則還沒有完全分離。32（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)原理樣品顆粒在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心后，沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處達到平衡，從而將不同密度的顆粒分離。特點所需的力場通常比速率區(qū)帶離心法大10100倍，往往需要高速或超速離心。33操作注意事項預(yù)先配置介質(zhì)的密度梯度溶液，將介質(zhì)和預(yù)分離樣品混合或者是置于梯度溶液頂部，這也是等密度區(qū)帶離心法產(chǎn)生梯度的兩種方法。離心所需時間以最小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準(zhǔn)，有時長達數(shù)日。一旦達到了平衡，再延長離心時間也不能改變粒子的成帶位置。（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)用途分離大小相同、密度不等的顆粒（如線粒體、溶酶體的分離。）34

例如：（1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。

（2）有針刺穿離心管底部滴出。

（3）

用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。

（4）用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。

（2）等密度離心法

(isopycnicsedimentation)收集區(qū)帶的方法35三、分析離心法分析性離心法：是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)的一種離心方法。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程，從而確定其物理性質(zhì)。如果離心機裝上一個光學(xué)系統(tǒng)，應(yīng)用特殊的透光離心池，就可以觀測離心池中樣品顆粒離心沉降的過程，進而對樣品進行直接的定性和定量分析。36沉降速度法：主要用于樣品純度檢查。沉降平衡法：常用的測量絕對分子量的方法。等密度區(qū)帶分析離心法：主要用在核酸的分析和研究中。三、分析離心法

分類37超速離心機工作原理圖解光源轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)頭樣品池光學(xué)系統(tǒng)液面沉降界面沉降物質(zhì)平衡池沉降界面峰濃度對距離的圖譜38四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，容量為幾十毫升至幾升。轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等。39高速離心機：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm，最大容量可達3升。轉(zhuǎn)頭多樣。一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C。通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器(如核蛋白體)或單個分子。

四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)40

超速離心機：轉(zhuǎn)速可達50000～80000rpm，相對離心力最大可達510000g，離心容量由幾十毫升至兩升，設(shè)有冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和安全保護系統(tǒng)。分離的形式是速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心。最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等。四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)41儀器特點

■轉(zhuǎn)速高達70,000rpm。

■日備有兩種檢測器，可供選擇：

．紫外(XL-A)：190-800nm，高靈敏度

．干涉光(XL-I)：適用于沒有紫外吸收之樣品，如碳水化合物，高濃度樣品

(<50D值)

■專利橢圓形全息衍射光柵、及四倍光束系統(tǒng)，減少散射光干擾。

■采用光電倍增管，大大提高檢測靈敏度。

■精確可靠的控制軟件及數(shù)據(jù)處理。

應(yīng)用范圍

■絕對／相對分子量測定

■樣品純度，濃度測定

■分子的聚和，解離分析

■熱動力學(xué)和流體力學(xué)參數(shù)確定

■核酸，蛋白及病毒測定與分析

■分子間之互相作用

■配合核磁共振應(yīng)用

分析超速離心機

42普通離心機：電動機、離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）、調(diào)速器、離心套管與底座。高速、超速（冷凍）離心機：驅(qū)動電機、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)（超離有）、顯示系統(tǒng)、自動保護系統(tǒng)和控制系統(tǒng)組成。必要的配件為離心轉(zhuǎn)頭和離心管。

四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)43（1）離心轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構(gòu)成。垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似。四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)44四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭45離心轉(zhuǎn)頭的注意事項1.每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。2.轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護。四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭46離心機轉(zhuǎn)頭損壞的原因（操作或使用不當(dāng)所造成的）過速腐蝕金屬疲勞不平衡四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)（1）離心轉(zhuǎn)頭47玻璃離心管絕對不能在高、超速離心機上使用。ＰＡ和ＰＰ管：化學(xué)性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒。ＰＣ管：透明度好，能耐高溫消毒。但不耐強酸強堿及某些有機溶劑。主要用于５萬轉(zhuǎn)／分以上離心。ＣＮ管：質(zhì)地較軟，透明，不能高壓消毒，但不耐強酸強堿及某些有機溶劑，適合于蔗糖、甘油等密度梯度離心。因透明，利于收集。四、離心機的分類與結(jié)構(gòu)離心管的選用48五、離心機的使用和維護離心方法的選擇一般是根據(jù)樣品顆粒的質(zhì)量和密度，選擇合適的離心方法。離心機的轉(zhuǎn)速和離心時間的確定：離心分離的效果除了與離心機種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度梯度外，實際操作時，與離心機轉(zhuǎn)速、離心時間、離心介質(zhì)的pH值和溫度等條件有關(guān)。49離心機的使用和維護原則離心機使用時要放置在平穩(wěn)