重離子輻照玉米的SSR分子標記分析

重離子輻照玉米的SSR分子標記分析演講：何凱制作：儲坤魏吉銀答辯：賴圣偉基本步驟1試驗材料選取由‘zC6+離子束輻照處理的玉米自交系CSR24001-1,魯9801、金象4C-1和鄭58、478、308。1.1樣品采集供試材料選取籽粒飽滿的玉米種子，用水浸泡3-5h,蒸餾水沖洗，置鋪于有蛙石的培養(yǎng)皿中，于250C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，待幼苗長至5-6d后剪取葉片迅速放入冰盒，以免水分散失。2.1技術(shù)路線該實驗選取田間經(jīng)不同能量、不同通量和不同處理的‘zC6+離子束輻照處理和未輻射對照玉米種子實驗室種植，選取幼嫩葉片為材料，進行玉米基因組DNA的提取，選用可擴增引物進行PCR擴增，通過SSR分子標記的分析研究輻照植株與未輻射對照植株之間的遺傳變異并進行類群的劃分，選出具有較大差異的材料。2.2藥品試劑及試驗設(shè)備2.2.1藥品試劑本試驗所用化學試劑均為分析純:TaqDNA聚合酶，瓊脂糖，dNTPs溟化乙錠，選用玉米通用SSR引物。2.2.2儀器設(shè)備高速低溫離心機，PCR擴增儀電冰箱，水浴鍋，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。2.3。1基因組DNA的提取1SDS快速提取法2CTAB法2.3.2DNA的檢測用TU-1810紫外分光光度計和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.4隨機引物的篩選在一定條引物逐一擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酞胺凝膠電泳后，再經(jīng)銀染，觀察結(jié)果，從中篩選出擴增條帶數(shù)較多，擴增清楚的引物，用這些引物對供試材料再作進一步擴增。2.5SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

SSR體系的優(yōu)化是以獲得最佳的擴增能力SSR的擴增能力為尺度對模板DNA或其他因素進行調(diào)整。2.6PCR擴增擴增條件及PCR所用的程序包括:變性、復性和擴增的溫度、時間以及循環(huán)的次數(shù)。理論上擴增能夠無限制地長期進行，但實際上受各種因素的制約。當循環(huán)次數(shù)少時擴增產(chǎn)物的量對于某種分析太少，當循環(huán)次數(shù)過多時，擴增的量不再增加。通常在30-45個循環(huán)。2.7擴增產(chǎn)物檢測2.7.1膠的制備加5-7u1擴增產(chǎn)物與2u1溟酚稱取定量的10%PAGE用干凈的玻璃棒攪拌均勻.2.7.2加樣加5-7u1擴增產(chǎn)物與2u1溟酚藍于封口膜上混合2.7.3電泳接通電源，電壓110V，電泳1h2.7.4銀染固定:(1)電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板(膠會緊貼在玻璃板上)，將凝膠置cm培養(yǎng)皿中，加入適量25%乙醇中，搖床固定5min，此時膠己完全脫離玻璃板(2)水洗:將膠置于適量蒸餾水搖床漂洗1mino(3)氧化:將膠置于適量1%HNO:中搖床4-6min(4)染色:將膠置于適量新配的2%AgNO:中染色(5)顯影:加入100ml新配的顯色液(3gNaC03}容至100ml中輕輕搖動至條帶完全出現(xiàn)。(6)定影:將顯出條帶的膠置于適量10%乙酸中1酸，保存拍照進行條帶分析。3數(shù)據(jù)分析用蒸餾水沖洗2-3次。20-30min，用蒸餾水沖洗1次。200u1甲醛，10u1硫代硫酸鈉定2min左右，用自來水沖洗殘留乙醇，SSR擴增帶型以0,1統(tǒng)計，建立數(shù)據(jù)庫。在相同遷移率位置上，有帶的記為A，無帶的記為B，統(tǒng)計每條引物擴增出的總帶數(shù)和其中的多態(tài)性帶數(shù)。采用NTSYS-pcversion-2.0統(tǒng)計軟件，按照NEh:法計算遺傳距離，并利用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀圖。4結(jié)果與分析4.1提取DNA的檢測基因組DNA的有效提取是進行任何DNA下游工作的前提和基礎(chǔ)，有效提取指的是得到的基因組DNA(總DNA)有足夠的量，盡可能少的降解和不含有影響下一步酶反應(yīng)的雜質(zhì)。

DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度，OD值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用HZO稀釋DNA樣品n倍并以HZO為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD26。值即可計算出樣品稀釋前的濃度:DNA(ng/ml卜50XOD26。讀數(shù)X稀釋倍數(shù)/1000oDNA純品的OD26o/ODZs。為1.8，故根據(jù)OD26o/ODZs。的值可以估計DNA的純度。若比值大于1.8說明含有DNA純度高，比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在

4.1.1DNA濃度檢測本試驗所采用的CTAB法和SDS法。結(jié)果表明:2種方法均可從樣本中提取到一定純度的DNAoSDS法提出的DNA的OD26。是0.083,ODZg。是0.062,OD26o/ODZgo是1.34，此法操作簡單，過程簡便，所以損失的DNA最少，但也因為純化步驟較少對應(yīng)的雜質(zhì)含量也較高，用CTAB法提取的總DNA的OD26。是0.074,ODZg。是0.04,OD26o/ODZs。是1.875,RNA和蛋白質(zhì)含量也很低，DNA質(zhì)量合乎要求。有研究認為，DNA中含有少量的RNA和蛋白質(zhì)對擴增影響不大。所以我們采用此方法用于本試驗SSR研究所需DNA樣品的提取。4.1.2DNA電泳檢測將提取DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。圖譜顯示，電泳譜帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，提取的DNA純度均一，為下一步擴增提供了有力保障。由下圖可知，用CTAB法所提取的玉米DNA帶型整齊、清晰、且無降解，基本沒有RNA和其他雜質(zhì)，完全符合該試驗的要求。4.2影響SSR穩(wěn)定性的重要因子4.2.1dNTP對穩(wěn)定性的影響

dNTP濃度的變化對帶的數(shù)量和強弱影響不是很明顯。dNTP作為PCR反應(yīng)的原料，其濃度的大小直接影響擴增反應(yīng)得產(chǎn)量和穩(wěn)定性。為了使dNTP與引物更好的結(jié)合Mgz+，我們將dNTP設(shè)置成5個不同體積梯度，進行其它條件不變的PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果表明:在20川的反應(yīng)體系中，dNTP的體積為2時-2.5川時擴增效果比較好，低于2時時，則擴增模糊，有時甚至不擴增;高于2時時擴增效果變差，這也許是由于高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤滲入，過高不擴增;但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，四種脫氧核普三磷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種是(偏高或偏低)，就會誘發(fā)聚合酶的錯誤深入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTPs與Mgz+鰲和而引起的效應(yīng)，并且在以后的PCR擴增中使得擴增的穩(wěn)定性也不理想，因此本實驗中dNTP的最適量為2.0時(圖2-2)o4.2.2Taq酶對穩(wěn)定性的影響

SSR擴增產(chǎn)物的質(zhì)量與TaqDNA聚合酶的含量密切相關(guān)，酶含量的高低直接影響擴增反映的效果，Taq酶用量過低時，產(chǎn)物合成效率降低。隨著Taq酶用量的增加，擴增條帶數(shù)量和亮度明顯增加，但隨著用量增加產(chǎn)生非特異性擴增從而使電泳帶型呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，背景也增加非常嚴重[}s6.s}}。試驗結(jié)果表明:在25時反應(yīng)體系中，當TaqDNA聚合酶用量在0.51.5時時，擴增帶型穩(wěn)定，且均能得到理想的擴增產(chǎn)物(圖2-3。而量過多時(>1.5}1)，往往引起非特異性擴增，所以為了SSR分析的穩(wěn)定和可靠，TaqDNA聚合酶的量以0.4時為宜(20時的體系中)。4.2.3DNA模板濃度對穩(wěn)定性的影響據(jù)文獻報道，在SSR分析時，不同植物所需的摸板DNA量各不相同[}ss}。為確定輻照玉米的SSR擴增反應(yīng)所需最適摸板DNA量，對DNA含量進行優(yōu)化，在其它條件不變的情況下進行SSR分析，選擇效果最好的模板量為將來體系模板的最佳體積。由PCR擴增結(jié)果可知(圖2-4，擴增體系為25貝時的最佳模板體積為1.0時4.2.4引物濃度對穩(wěn)定性的影響引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，因為PCR反應(yīng)開始時，首先必須使雙鏈DNA解離為單鏈，使之與引物相結(jié)合，在TaqDNA聚合酶的催化下以引物為復制起點進行DNA鏈的延伸[}s9.90.9y。引物的量過少時，與模板結(jié)合機率降低，擴增受到影響;當引物升高時，小分子兩條帶亮度增加，大分子量條帶減弱，同時背景增高，引起錯配和非特異性擴增，這和引物用量過高產(chǎn)生引物二聚體或多聚體導致特異擴增增加有關(guān)。因此，確定適合的引物用量很重要。結(jié)果表明:在0.1-1.5時之間都可擴增出條帶，但引物量較低(<1川)時條帶較少;引物量較高(>2時)時，引物自身會配對出現(xiàn)一些二聚體及多聚體，所以實驗中的引物量以1時左右為宜。當引物用量為1.0川each時，均可擴增獲得清晰的條帶。4.2.5Mg2+濃度對穩(wěn)定性的影響

Mgz+作為維持Taq酶活性的重要輔助因子間接影響擴增效果。當Mgz+用量增加

時背景升高，條帶變模糊，可能是由于Mgz+濃度過高導致一些非特異性的擴增。由

PCR擴增結(jié)果可知(圖2-6，擴增體系為25時時的最佳模板體積為2.0時。

4.3DNA多態(tài)性分析

4.3.1引物篩選

在本試驗的20對引物中，有的引物對37個輻照玉米材料不能擴增出任何譜帶，有

的引物擴增出的譜帶較弱且僅能對部分材料擴增。實驗篩選出18個對供試材料擴增譜

帶具有較好重復性和清晰性的引物。由于不同引物的序列不同，G+C含量也不一樣，

因而對品種鑒定和親緣關(guān)系的分析結(jié)果有一定影響，因此，選擇一定數(shù)量的引物對供

試材料進行擴增是獲得客觀結(jié)果的前提。

4.3.2重離子輻照玉米的SSR多態(tài)性分析圖2-7bn1g1450k2隨機引物的SSR}l、一增圖譜M為}DNA-HindII工分了量標記FigFingerprintsofSSRproductsfrombn1g1450k2注:圖中M的分了量依次為一600bp}SOObp}400bp}300bp}200bp}100bp1-37為供試材料序圖2-8umc2084w2隨機引物的SSR}l、一增圖譜M為}DNA-HindII工分了量標記FigFingerprintsofSSRproductsfromumc2084w2M:}DNA-HindIII注:圖中M的分了量依次為一600bp}SOObp}400bp}300bp}200bp}100bp1-37為供試材料序號

根據(jù)試驗結(jié)果統(tǒng)計，18對SSR引物共檢測到56個等位位點的變異，每對引物檢測等位基因位點2-6個，平均3.11個。其中，引物umc1741k7擴增出的多態(tài)性最高，檢測出6個等位基因變異;bnlg1792k8檢出5個;bn1g1754w3檢出4個;bn1g1450k2,bn1g1702k1、umc2084w2、bn1g2291k4,phi080k15、bn1g439w1、phi065k9、umc2163k5、umc1705w1,bn1g125k1,bn1g439w1,phi0724k4檢出3個;bnlg1940k9,umc21OSk3,phi072k4,bn1g161k8檢出2個。4.3.3聚類結(jié)果分析以SSR遺傳相似系數(shù)為原始數(shù)據(jù)，按UPGMA方法對37份材料進行聚類分析，共分為四類:F30與其它材料相比具有較大的差異，故單獨成為一類;E10}E20}E30}E40}E50}Eck為一類群。在這一組中，E10}E30為一亞類，說明在自交系308中，輻射劑量為IOGy,30Gy的處理遺傳相似系數(shù)很近，在遺傳上具有很大的同源性;輻照劑量為40Gy的308與對照處理為同一亞類;E20}E50同理。A10}A15}A20}A30}Ack,C30}D20}D25}D30亞類，B25}Dck,F10}F20}F50}Fck與C20}C25}Cck,D10}D15}F40三個亞群組成了另一類群;A25}C10}C15與B10}B15}B20}Bck,B30}CS兩個亞群組成了另一類群(圖2)05.3重離子輻照玉米的SSR分析一般SSR引物在每一個自交系中