紫外分光光度計(jì)

紫外-可見吸收光譜法紫外-可見吸收光譜法及其應(yīng)用生物制藥12（1）班紫外吸收光譜和可見吸收光譜都屬于分子光譜，它們都是由于價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的。利用物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光的吸收所產(chǎn)生的紫外可見光譜及吸收程度可以對物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測定、推斷。在有機(jī)化合物分子中有形成單鍵的σ電子、有形成雙鍵的л電子、有未成鍵的孤對n電子。當(dāng)分子吸收一定能量的輻射能時(shí)，這些電子就會躍遷到較高的能級，此時(shí)電子所占的軌道稱為反鍵軌道，而這種電子躍遷同內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。在紫外吸收光譜中，電子的躍遷有σ→σ*、n→σ*、π→π和n→π*四種類型，各種躍遷類型所需要的能量依下列次序減?。害摇?;n→σ*;π→π*&;n→π*紫外吸收光譜形成原理提供激發(fā)能,使待測分子產(chǎn)生吸收要求能夠提供足夠強(qiáng)的連續(xù)光譜、有良好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命,且輻射能量隨波長無明顯變化常用的光源有鎢燈和氘燈光源單色器使光源發(fā)出的光變成所需要的單色光通常由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、物鏡和出射狹縫構(gòu)成

吸收池檢測器記錄儀特點(diǎn)用于盛放試液石英池用于紫外-可見區(qū)的測量玻璃池只用于可見區(qū)記錄及處理數(shù)據(jù)使用兩只光電管一是氧化銫光電管（625——1000）二是銻銫光電管（200——625）在紫外可見區(qū)的靈敏度高，響應(yīng)快。但強(qiáng)光照射會引起不可逆損害，因此高能量檢測不宜，需避光紫外可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)紫外-可見分光光度計(jì)的基本構(gòu)造影響紫外光譜因素共軛效應(yīng)的影響π電子共軛體系增大，電子離域到多個(gè)原子之間，導(dǎo)致π—π*能量降低。

λmax紅移，ε

max增大

取代基越大,分子共平面性越差，空間阻礙使共軛體系破壞，

λmax藍(lán)移，ε

max減小。助色基團(tuán)取代p

→p*（K帶)發(fā)生紅移2023/2/46:45取代基的影響給電子基帶有未共用電子對的原子的基團(tuán)。如-NH2,-OH等。未共用電子對的流動(dòng)性很大，能夠和共軛體系中的π電子相互作用引起永久性的電荷轉(zhuǎn)移，形成p-π共軛，降低了能量，

λmax紅移。共軛體系中引入吸電子基團(tuán)，也產(chǎn)生π電子的永久性轉(zhuǎn)移，

λmax紅移。π電子流動(dòng)性增加，吸收光子的吸收分?jǐn)?shù)增加，吸收強(qiáng)度增加。給電子基與吸電子基同時(shí)存在時(shí)，產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移吸收，

λmax紅移，ε

max增加2023/2/46:45溶劑的影響1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮

非極性→極性n

→

*躍遷：蘭移；；

→*躍遷：紅移；；極性溶劑使精細(xì)結(jié)構(gòu)消失；紫外-可見分光光度法的應(yīng)用范圍

幾乎所有的無機(jī)元素和在紫外及可見光區(qū)有特征吸收的有機(jī)物或有機(jī)化合物都能用紫外/可見分光光度法進(jìn)行測定。目前，紫外可見分光光度計(jì)已成為全世界歷史最悠久、使用最多、覆蓋面最廣的常規(guī)分析儀器。紫外-可見分光光度法的應(yīng)用范圍

紫外-可見分光光度法的應(yīng)用范圍涉及化學(xué)化工、醫(yī)療衛(wèi)生、冶金地質(zhì)、食品飲料、農(nóng)業(yè)化肥、畜牧水產(chǎn)、機(jī)械制造、計(jì)量科學(xué)、環(huán)保、制藥、生物、材料、石油等領(lǐng)域中的科研、教學(xué)、生產(chǎn)中的質(zhì)量控制、原材料和產(chǎn)品檢驗(yàn)等各個(gè)方面，進(jìn)行定性分析、定量測定、純度檢查、動(dòng)力學(xué)研究等等。紫外-可見分光光度法的應(yīng)用-定性分析

不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)吸收光譜也不同，這是對物質(zhì)進(jìn)行定性分析的基礎(chǔ)：通過檢測吸收光譜來比對鑒定分析物質(zhì)。

波長范圍吸光度利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性分析

在相同條件下，測定未知物的吸收光譜，與標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜進(jìn)行比較，如果兩吸收光譜的形狀和吸收峰的數(shù)目、位置、拐點(diǎn)等完全一致，就可初步判定未知物與標(biāo)準(zhǔn)物是同一種物質(zhì)。在進(jìn)行定性鑒定時(shí)，需要注意：1.測試溶劑：應(yīng)當(dāng)對標(biāo)準(zhǔn)物和待測物有良好的溶解度，本身在測定的波長內(nèi)無光的吸收，有良好的穩(wěn)定性。2.測試的條件：標(biāo)準(zhǔn)物和待測物測試條件要完全相同，如溶劑、PH、離子強(qiáng)度、溫度及所用儀器等。3.更改測試條件：為了防止測試數(shù)據(jù)的假象，要對現(xiàn)有某些條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖儞Q，改變其中的某些測定條件，然后看標(biāo)準(zhǔn)物和待測物的吸收光譜是否仍然完全相同。紫外-可見分光光度法的應(yīng)用-定量分析Lambert–Beer光吸收定律：當(dāng)一束平行單色光通過均勻的樣品時(shí)，其吸光度與吸光組分的濃度、吸收池的厚度乘積成正比.入射光I0透射光ItLC紫外-可見分光光度法的應(yīng)用-定量分析波長范圍吸光度最大吸收波長利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析在一定波長（λmax）下測定某物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品溶液的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液的濃度或含量。

01.02.03.04.0c(mg/mL)。。。。0.800.600.400.200.00Axcx1.單組分物質(zhì)的定量分析（1）比較法：在相同的條件下配制樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液（與待測組分的濃度近似），在相同的實(shí)驗(yàn)條件和最大波長處分別測得吸光度Ax和As，然后進(jìn)行比較，求得樣品溶液中待測組分的濃度，Cx=Cs×(Ax/As)。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：首先配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最大吸收波長處分別測得標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，然后，做A-c的校正曲線（理想的曲線應(yīng)為經(jīng)過原點(diǎn)的直線）。在完全相同的條件下測出試液的吸光度，并從曲線上求得相應(yīng)的試液的濃度。2.多組分物質(zhì)的定量分析

根據(jù)吸光度加和性原理，對于兩種或兩種以上吸光組分的混合物的定量分析，可不需要分離而直接測得。

AXY12根據(jù)加合性原則，解聯(lián)立方程法AXY12k為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測得。解聯(lián)立方程，可求得Cx,CyACs(x)2.多組分物質(zhì)的定量分析

實(shí)踐&應(yīng)用PracticeandApplication化合物在紫外區(qū)沒有吸收峰，但雜質(zhì)有較強(qiáng)的吸收，就可以方便檢出該化合物中痕量雜質(zhì)1.痕量雜質(zhì)的檢出水、土壤、空氣、植物、糧食中污染物的鑒定和定量分析。如農(nóng)藥殘留、土壤中污染物的分析測定等。2.污染物的成分及含量的測定動(dòng)、植物脂肪酸的分析，蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸的測定等。3.動(dòng)、植物生物成分的分析如圖為苯在乙醇中的紫外光譜吸收帶。苯在=180和204nm處有2個(gè)強(qiáng)吸收帶E1，E2，在230-270有較弱的一系列吸收帶，稱為B吸收帶。要鑒定甲醇或乙醇中的雜質(zhì)苯，可利用苯在256nm處的B吸收帶，而甲醇或乙醇在此波長幾乎沒有吸收。當(dāng)今社會石油工業(yè)迅速發(fā)展，全球每年進(jìn)入環(huán)境的石油污染物約有近800萬噸，對生態(tài)環(huán)境和社會環(huán)境造成危害。在出油率較低的石油中，可用紫外分光法測定，相對偏差較小，有更好的重現(xiàn)性，結(jié)果較穩(wěn)定?？勺鳛榭焖俜治鐾寥乐惺臀廴疚锏姆椒?。紫外熒光定硫儀用于石油產(chǎn)品的檢測。2023/2/46:45旋光異構(gòu)：兩個(gè)或多個(gè)分子由于構(gòu)型上的差異而表現(xiàn)出不同旋光性能的現(xiàn)象。這些分子互為旋光異構(gòu)體，也稱對映異構(gòu)體。下圖為：乳酸的兩種旋光異構(gòu)體。2023/2/46:45從1962年5月～1963年3月，僅僅10個(gè)月中，西德就有5500名“海豹兒”出生，還有相當(dāng)多孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)和死產(chǎn)。造成嬰兒海豹肢畸形的“罪魁禍?zhǔn)住保菋D女懷孕初期服用“反應(yīng)?！被瘜W(xué)藥名為“酞胺哌啶酮”所致。1953年在德國首先被合成出來，作為鎮(zhèn)靜劑用于臨床，并且多用于孕婦的妊娠早期止吐。然而當(dāng)時(shí)歐洲藥學(xué)家對酞胺哌啶酮的這個(gè)旋光異構(gòu)無知，右旋體可以減輕孕婦的嘔吐反應(yīng)，而左旋體則不僅沒有藥用活性，還會導(dǎo)致胎兒在發(fā)育時(shí)畸形。利用紫外可見法，對藥品中的異構(gòu)體進(jìn)行深入研究。有益于保障人類的健康。最新技術(shù)

1.“褶合光譜”

法

“褶合光譜”法是我國第二軍醫(yī)大學(xué)的吳玉田教授發(fā)明的。此法測量樣品時(shí)，不需要對試樣經(jīng)過分離,可以直接用紫外可見分光光度計(jì)分析含有6個(gè)不同組分的試樣。

此法對于藥物分析工作來講,是一個(gè)重大的突破,在新藥開發(fā)、疾病診斷、食品科學(xué)、產(chǎn)品質(zhì)控、環(huán)境毒性分析等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

2.聯(lián)用技術(shù)－紫外可見分光光度計(jì)與HPLC聯(lián)用

把HPLC的紫外檢測器去掉,將紫外可見分光光度計(jì)接上一只流動(dòng)池,連接到HPLC的柱后,就組成了一個(gè)新的、完整的HPLC-紫外可見分光光度計(jì)分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以利用HPLC的高效分離功能和紫外可見分光光度計(jì)的準(zhǔn)確度高、靈敏度高、選擇性好的功能，能解決單臺HPLC或單臺紫外可見分光光度計(jì)不能解決的許多分析問題。2.聯(lián)用技術(shù)－紫外可見分光光度計(jì)與HPLC聯(lián)用

1.在使用儀器前，必須仔細(xì)閱讀其使用說明書,測量前必須將比色皿外壁的殘液用擦鏡紙洗干凈，以保持樣品池的潔凈2.若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正“0”和“100%”點(diǎn)。然后再測量。3.指針式儀器在未接通電源時(shí)，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進(jìn)行機(jī)械調(diào)零。4.不要頻繁開關(guān)儀器5.應(yīng)保證比色皿不傾斜放置。稍許傾斜，就會使參比樣品與待測樣品的吸收光徑長度不一致，還可能使入射光不能全部通過樣品池，導(dǎo)致測試比準(zhǔn)確度不符合要求。6.比色皿架推拉到位。若不到位，將影響到測試值的重復(fù)性或準(zhǔn)確度。7.儀器的工作環(huán)境：應(yīng)避免陽光直