第6章基因操作中大分子的分離和2013

補(bǔ)課安排第7周周7第11節(jié)N1-104

第8周周3第7節(jié)N1-121第六章

基因操作中大分子的分離和分析第一節(jié)DNA的分離、檢測(cè)和純化第二節(jié)RNA的分離、檢測(cè)和純化第三節(jié)分子雜交第四節(jié)RNA作圖和端點(diǎn)分析第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌第一節(jié)DNA的分離、檢測(cè)和純化一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳五、DNA片段的純化一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化依據(jù)是利用分子大小不同和質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分離。目前最常用的是堿裂解法。1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理◆堿裂解法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的?！粼趐H高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取步驟堿抽提法所用試劑的生化作用

提取過(guò)程中所用的材料有LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、3mol/L乙酸鉀溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用,同時(shí)有利于溶菌酶的作用。

②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來(lái)。③KAc:

pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

④無(wú)水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。⑥異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

152通過(guò)試劑盒分離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的基本原理一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說(shuō)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。2、影響電泳遷移速率的因素：1）分子篩效應(yīng)DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。

2）相對(duì)分子質(zhì)量具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時(shí)，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。

3）構(gòu)型質(zhì)粒DNA超螺旋(SC)、開環(huán)狀(OC)、線狀(L)

3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1）DNA的顯示原理：制備瓊脂糖凝膠時(shí)加入溴化乙錠指示劑，溴化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射桔紅色的熒光。熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量。若用薄層分析掃描儀檢測(cè)，只需要5～lOngDNA，就可以從照片上比較鑒別。如用肉眼觀察，可檢測(cè)到0.01～0.1μg的DNA。EB染色原理

當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。

瓊脂糖含（%）DNA片段的有效分離范圍(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程A、緩沖液制備B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、將點(diǎn)樣梳洗凈干燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中融化。

融化好后冷卻到60℃左右，加入EB溶液，至最終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好點(diǎn)樣梳的膠板中，排走氣泡。室溫放置30-45min。2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程E、加樣和電泳：將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍加入DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時(shí)間。可根據(jù)溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍照2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程2）瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm常用的Marker三、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：分辨率高適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp載樣量大回收DNA純度高PAGE裝置電泳PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。專門針對(duì)大片段DNA的分析檢測(cè)方法。+++-----2五、DNA片段的純化DNA經(jīng)過(guò)酶切并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析在凝膠上會(huì)呈現(xiàn)DNA條帶，從中分離特定大小的DNA片段可用于進(jìn)一步深入的研究。常用的DNA純化方法有：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、“基因純”試劑純化等。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺(tái)式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。1）切膠，放入1.5ml離心管中；2）加入溶膠液，置55℃水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；3）瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm室溫離心1分鐘，倒掉收集管中的液體；4）在吸附柱中加入漂洗液，室溫靜置1分鐘后，12000rpm室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體；5）重復(fù)漂洗一次；6）12000rpm室溫空離心1分鐘；7）將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后，12000rpm室溫離心1分鐘；8）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物；凝膠純化結(jié)果示意圖透析袋電洗脫法適用于小劑量DNA純化和酶切DNA片段回收。步驟：電泳分帶。切膠，裝入透析袋，進(jìn)行電泳1-2h后，再反向電泳1-2min。洗脫液離心。轉(zhuǎn)移，加入2倍體積無(wú)水乙醇混勻，于-20℃放置過(guò)夜沉淀后，離心后去除上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)凝膠電泳回收的DNA樣品，因檢測(cè)需要而含有溴化乙錠(EB)，會(huì)影響限制性核酸內(nèi)切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或異戊醇)抽提或Dowex(道?？怂?樹脂層析法等。DNA的濃縮

當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，必須進(jìn)行DNA溶液的濃縮。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有：

乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等。

乙醇沉淀

DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇來(lái)沉淀DNA以達(dá)到純化DNA的目的。乙醇沉淀是濃縮DNA的常用方法。1、按DNA溶液量的1/10體積加入3mmol/LNaAc。2、加2.5倍體積的預(yù)冷100%乙醇，蓋上蓋子混勻。3、-70℃靜置15min，或-20℃靜置1h以上。4、4℃、15000r/min，離心15min，沉淀DNA。5、棄上清。6、加70%乙醇適量，漂洗沉淀，再次離心。7、干燥10~30min。8、加TE溶解。鹽能中和核酸上的電荷，因此易使DNA沉淀，但加入過(guò)多易產(chǎn)生鹽析。（四）DNA的定量和純度測(cè)定

DNA樣品的濃度的測(cè)定，一般采用紫外光譜分析、EB熒光分析、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。

紫外光譜分析法

紫外光譜分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來(lái)校正。該法的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但所需儀器較昂貴。衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值表示，OD260/OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8則可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時(shí)則有蛋白質(zhì)污染。雙鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為50μg/mL。單鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。寡核酸的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為20-40μg/mL。EB熒光分析法由于結(jié)合于DNA分子之上的EB的量與DNA分子長(zhǎng)度和數(shù)量成正比，則熒光強(qiáng)度可以表示DNA量的多少。EB是嫌疑性的致突變物質(zhì)。第二節(jié)RNA的分離、檢測(cè)和純化細(xì)胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等）。

－1%～5%mRNA，一般按2%計(jì)算。Trizol法提取細(xì)胞總RNARNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備RNA很重要。常用的RNA酶抑制劑：焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用）異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使RNA酶失活。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：酸性糖蛋白。（合成cDNA階段使用）1.在實(shí)驗(yàn)室最好有專門的RNA操作區(qū)，離心機(jī)、移液器、試劑等專用。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進(jìn)行除菌。

2.相關(guān)耗材(Ep管、Tip頭)應(yīng)先用0.1%DEPC水浸泡過(guò)夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應(yīng)的無(wú)RNase的Ep管、Tip頭。3.金屬器械和玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。注意事項(xiàng)4.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗5.配制的溶液應(yīng)盡可能加入DEPC至終濃度0.1%處理12hr以上，然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。（不能用DEPC或高壓滅菌的試劑，如Tris、DTT等，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌）6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中應(yīng)戴手套，避免講話。Trizol是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離。酸性苯酚促使RNA進(jìn)入水相，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，離心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。水相加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總RNA。Trizol法提取原理真核生物mRNA的純化（1）寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA（2）磁性分離技術(shù)純化mRNA（1）寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA磁性分離技術(shù)純化mRNA先將連有生物素的oligo(dT)引物與mRNA3’-端的polyA一起雜交；加入連有生物素結(jié)合蛋白的磁球，使雜交體與磁球結(jié)合；通過(guò)磁場(chǎng)作用，使連有雜交體的磁球與其他RNA分離；通過(guò)洗脫將連在磁球上的mRNA洗脫下來(lái)而得到純化的mRNA。該方法簡(jiǎn)單、迅速、不易引起mRNA的降解。RNA的電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度可通過(guò)測(cè)試其OD260來(lái)判斷，OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。28S18S總RNA電泳條帶第三節(jié)分子雜交

一、Southern雜交二、Northern雜交三、菌落原位雜交四、Western雜交分子雜交

(moleculehybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象的不同可分為

Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，及由此簡(jiǎn)化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過(guò)程中兩個(gè)不同來(lái)源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。

一、Southern雜交

這種方法是E.M.Southern1975年建立,是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：

（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，雙鏈的DNA樣品變性。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上4.雜交：雜交之前須有一個(gè)預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交時(shí)背景吸附探針。封閉試劑成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白質(zhì)等。將濾膜移入含有放射性同位素標(biāo)記的探針?lè)肿尤芤褐校瑸V膜上的單鏈DNA分子與探針?lè)肿油ㄟ^(guò)互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行雜交，形成雜種分子。

5.漂洗：將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針?lè)肿悠聪聛?lái)。6.放射自顯影：在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針?lè)肿咏Y(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個(gè)片段。1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過(guò)毛細(xì)管滲析法轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測(cè))5.結(jié)果檢測(cè)，比較鑒定。（一）Southern雜交的操作步驟Southern印跡雜交方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果十分靈敏。在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。

1.硝酸纖維素濾膜

在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:

（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固。（二）Southern雜交的雜交濾膜（2）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度。（4）硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量的DNA片段(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。2.尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底較硝酸纖維素濾膜高。

將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。二、Northern雜交Northern雜交的過(guò)程①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。三菌落原位雜交

（colonyinsituhybridization）直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，再與特異性DNA探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落。菌落原位雜交的操作步驟

四Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定結(jié)合在一起的檢測(cè)方法，具有很高的靈敏度（50ng）。原理：先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點(diǎn)然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合再加入能與一抗專一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentWestern雜交的操作步驟

總結(jié)◆

Southern印跡法（DNA印跡法,Southernblotting）：是一種把DNA電泳分離區(qū)帶轉(zhuǎn)移到支持膜上的技術(shù)?！?/p>

Northern印跡法（RNA印跡法,Northernblotting）：Alwine等人將Southern印跡法應(yīng)用于RNA，原理與Southern印跡法相似?！?/p>

Western印跡法（蛋白質(zhì)印跡法，Westernblotting）：是一種從混合蛋白質(zhì)中檢出微量特定蛋白質(zhì)的方法。◆

Eastern印跡法（Easternblotting）：也是一種蛋白質(zhì)印跡法，與Western印跡法不同之處是：先用等電聚焦-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF）分離蛋白質(zhì)，然后也是將蛋白質(zhì)的分離區(qū)帶、以電驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行了印跡。一、RNA的S1核酸酶作圖：分析原mRNA加工剪接為成熟mRNA中的剪切區(qū)段和邊界。二、S1核酸酶作圖分析mRNA端點(diǎn)：5’和3’端均可分析。三、引物延伸法分析mRNA的端點(diǎn)：只能用于5’末端的作圖。第四節(jié)RNA作圖和端點(diǎn)分析(自學(xué))RNA的S1核酸酶作圖分析mRNA端點(diǎn)引物延伸法分析mRNA的端點(diǎn)第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一

選擇受體細(xì)胞的基本原則二

重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌基本概念●

受體細(xì)胞(receptorcell)

又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(hostcell)等，能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。

●

感受態(tài)(competence)

細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)?！窀惺軕B(tài)細(xì)胞(competentcell)

處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞。●

細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程?！褶D(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。●

轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過(guò)程?！?/p>

轉(zhuǎn)染(transfecti