第八章++蛋白質工程

第八章蛋白質工程

湖南師范大學生命科學學院

袁婺洲本章目錄蛋白質工程的理論基礎蛋白質工程的理論基礎蛋白質結構測定與結構預測蛋白質工程的關鍵技術定點突變定向進化其他技術蛋白質工程的應用及實例定點突變與蛋白質藥物工程：胰島素定點突變、定向進化與工業(yè)用酶：枯草桿菌蛋白酶等結構域的拼接與金屬硫蛋白工程抗體工程

第一節(jié)蛋白質工程的理論基礎蛋白質工程的概念蛋白質的結構蛋白質結構預測一蛋白質工程的概念基于對蛋白質結構和功能的認識，進行分子設計，通過基因工程途徑定向地改造蛋白質或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質的理論或實踐活動。（1）確定蛋白質化學組成、空間結構與生物功能之間的關系；（2）通過定點突變、定向進化等技術，合成具有特定氨基酸序列和空間結構的蛋白質。二蛋白質的結構一級結構：多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序二級結構：多肽鏈借助于氫鍵或離子鍵沿一維方向排列成具有周期性結構的圖象。三級結構：指整個蛋白質多肽鏈在二級結構的基礎上，側鏈基團通過次級鍵或疏水鍵的相互作用進一步盤曲折疊，形成具有一定規(guī)則的空間結構。四級結構：由兩條以上的多肽鏈組成的蛋白質，多肽鏈之間沒有共價鍵連接而是借疏水作用等次級鍵締合在一起形成的高級空間結構。氨基酸的聚合形成肽鏈肽鏈的空間結構單元:二硫鍵的折疊肽鏈的空間結構單元:氫鍵的折疊肽鏈的空間結構單元:離子鍵的折疊肽鏈的空間結構單元每四個氨基酸殘基間的氫鍵構成多肽鏈

a螺旋肽鏈的空間結構單元由不同多肽鏈上氨基酸殘基間的氫鍵構成多肽鏈

b折疊肽鏈的完整空間構象蛋白質結構與功能的關系蛋白質一級結構是空間結構的基礎，而空間結構決定了蛋白質的功能。結構域：蛋白質多肽鏈上一段在三維結構上可以明顯區(qū)分和相對獨立并具有一定生物學功能的基本單位。

模體（基序）：組成結構域的基本二級結構單位蛋白質的加工修飾:磷酸化修飾蛋白質的加工修飾:羧基化修飾幾種參與凝血的蛋白因子（如VIII和IV因子）需要在其谷酰胺側鏈上的g-羧基化修飾后，才能擁有蛋白酶的活性，這一修飾過程依賴與維生素K的存在。蛋白質的加工修飾:甲基化修飾肌肉中的一些蛋白質以及細胞色素C中的Lys會受到單甲基和二甲基化修飾；鈣調蛋白會受到三甲基化修飾；所有C末端以Glu結尾的蛋白質，其Glu會受到甲基化修飾。蛋白質的加工修飾:N-糖基化O-糖基化糖基化修飾蛋白質的加工修飾:其它類型的修飾三蛋白質的結構預測一級結構：測序儀與數據庫高級結構預測：

X射線晶體衍射法核磁共振法（NMR）蛋白質一級序列數據庫PIR：由國家生物醫(yī)學研究基金會（NBRF）建立MIPS：Martinsried的蛋白質序列研究所收集和處理的蛋白質序列數據SWISS-PROT

：蛋白質序列數據庫，由Geneva大學和EMBL共同合作開發(fā)TrEMBL：翻譯的EMBL

NRL-3D：除序列信息外，也包括對二級結構，活性位點，結合位點和修飾位點等信息。第二節(jié)蛋白質工程關鍵技術定點突變定向進化其他技術一定點突變寡核苷酸引物介導的定點突變PCR介導的定點突變盒式突變遺傳信息傳遞的中心法則DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白質生物代謝物質復制轉錄翻譯代謝基因組學轉錄組學蛋白組學代謝組學逆轉錄中心法則1.寡核苷酸引物介導的定點突變

用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進行復制的過程寡核苷酸引物介導的定點突變的Kunkel改進：載體：RF－M13DNA載體

菌株：dUTP酶和N－尿嘧啶脫核苷酶雙缺陷的菌株。原理：dUTP酶缺陷導致胞內dUTP上升，部分取代dTTP進入新生DNA鏈中，使得M13單鏈DNA大約1％的T被U取代。另一鏈合成后，將雙鏈DNA導入正常大腸桿菌，N－尿嘧啶糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原M13模板鏈被降解，突變鏈因不含U被保留下來。

2.PCR介導的定點突變3.盒式突變利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應序列。突變的寡核苷酸鏈成對存在，不會出現異源雙鏈的情況。全部轉化質粒都是突變體。二、定向進化先隨機突變，再定向選擇。如在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用Taq酶不具有3－5端糾錯的功能，配合適當條件，以很低的比率向目的基因引入突變，構建突變序列庫，再憑借定向的選擇方法，定向選出所需性質的突變酶。1.易錯PCR

在PCR反應中，降低一種dNTP的含量，使PCR容易出錯，達到隨機突變的目的。2.DNA改組用DNAaseI

先將一個DNA片段消化成許多小片段，然后不加引物進行PCR，使得消化后DNA小段之間重新按多種組合方式連接重組，然后利用原來整片段DNA兩端的引物進行加引物的PCR擴增，以便得到一系列改組后的突變DNA序列。3.體外隨機引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，隨機引物擴增，將產生大量與模板不同位點互補的短的DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中會存在一些點突變。第三節(jié)蛋白質工程的應用實例胰島素枯草桿菌蛋白酶金屬硫蛋白抗體1.胰島素的結構及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRR

KSSSSCNSSNC高爾基體內的特異性肽酶NCB肽C肽A肽信號肽酶信號肽胰島素的改建工程速效胰島素：SerB9Asp/ThrB27Glu，有利于降低胰島素的締合作用，進入血液的吸收率比天然胰島素提高了3倍。長效胰島素：AsnA21Gly/ThrB27Arg/ThrB30Thr酰胺，半衰期最長，達到35.5小時。高效胰島素：HisB10Asp,活力是天然胰島素的11.7倍?？贵w抗體是一類免疫球蛋白IgG基本結構

重鏈（heavychain，H）輕鏈（lightchain，L）

可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）恒定區(qū)（co