第八章++蛋白質(zhì)工程

第八章蛋白質(zhì)工程

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

袁婺洲本章目錄蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵技術(shù)定點(diǎn)突變定向進(jìn)化其他技術(shù)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用及實(shí)例定點(diǎn)突變與蛋白質(zhì)藥物工程：胰島素定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化與工業(yè)用酶：枯草桿菌蛋白酶等結(jié)構(gòu)域的拼接與金屬硫蛋白工程抗體工程

第一節(jié)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一蛋白質(zhì)工程的概念基于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)，進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，通過基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的理論或?qū)嵺`活動(dòng)。（1）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；（2）通過定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等技術(shù)，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。二蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助于氫鍵或離子鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的圖象。三級(jí)結(jié)構(gòu)：指整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，側(cè)鏈基團(tuán)通過次級(jí)鍵或疏水鍵的相互作用進(jìn)一步盤曲折疊，形成具有一定規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩條以上的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，多肽鏈之間沒有共價(jià)鍵連接而是借疏水作用等次級(jí)鍵締合在一起形成的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)。氨基酸的聚合形成肽鏈肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:二硫鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:氫鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:離子鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元每四個(gè)氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈

a螺旋肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元由不同多肽鏈上氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈

b折疊肽鏈的完整空間構(gòu)象蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而空間結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能。結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)多肽鏈上一段在三維結(jié)構(gòu)上可以明顯區(qū)分和相對(duì)獨(dú)立并具有一定生物學(xué)功能的基本單位。

模體（基序）：組成結(jié)構(gòu)域的基本二級(jí)結(jié)構(gòu)單位蛋白質(zhì)的加工修飾:磷酸化修飾蛋白質(zhì)的加工修飾:羧基化修飾幾種參與凝血的蛋白因子（如VIII和IV因子）需要在其谷酰胺側(cè)鏈上的g-羧基化修飾后，才能擁有蛋白酶的活性，這一修飾過程依賴與維生素K的存在。蛋白質(zhì)的加工修飾:甲基化修飾肌肉中的一些蛋白質(zhì)以及細(xì)胞色素C中的Lys會(huì)受到單甲基和二甲基化修飾；鈣調(diào)蛋白會(huì)受到三甲基化修飾；所有C末端以Glu結(jié)尾的蛋白質(zhì)，其Glu會(huì)受到甲基化修飾。蛋白質(zhì)的加工修飾:N-糖基化O-糖基化糖基化修飾蛋白質(zhì)的加工修飾:其它類型的修飾三蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)：測(cè)序儀與數(shù)據(jù)庫(kù)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：

X射線晶體衍射法核磁共振法（NMR）蛋白質(zhì)一級(jí)序列數(shù)據(jù)庫(kù)PIR：由國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)（NBRF）建立MIPS：Martinsried的蛋白質(zhì)序列研究所收集和處理的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)SWISS-PROT

：蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，由Geneva大學(xué)和EMBL共同合作開發(fā)TrEMBL：翻譯的EMBL

NRL-3D：除序列信息外，也包括對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)和修飾位點(diǎn)等信息。第二節(jié)蛋白質(zhì)工程關(guān)鍵技術(shù)定點(diǎn)突變定向進(jìn)化其他技術(shù)一定點(diǎn)突變寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變盒式突變遺傳信息傳遞的中心法則DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白質(zhì)生物代謝物質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯代謝基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白組學(xué)代謝組學(xué)逆轉(zhuǎn)錄中心法則1.寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變

用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制的過程寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變的Kunkel改進(jìn)：載體：RF－M13DNA載體

菌株：dUTP酶和N－尿嘧啶脫核苷酶雙缺陷的菌株。原理：dUTP酶缺陷導(dǎo)致胞內(nèi)dUTP上升，部分取代dTTP進(jìn)入新生DNA鏈中，使得M13單鏈DNA大約1％的T被U取代。另一鏈合成后，將雙鏈DNA導(dǎo)入正常大腸桿菌，N－尿嘧啶糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原M13模板鏈被降解，突變鏈因不含U被保留下來。

2.PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變3.盒式突變利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。突變的寡核苷酸鏈成對(duì)存在，不會(huì)出現(xiàn)異源雙鏈的情況。全部轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都是突變體。二、定向進(jìn)化先隨機(jī)突變，再定向選擇。如在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用Taq酶不具有3－5端糾錯(cuò)的功能，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因引入突變，構(gòu)建突變序列庫(kù)，再憑借定向的選擇方法，定向選出所需性質(zhì)的突變酶。1.易錯(cuò)PCR

在PCR反應(yīng)中，降低一種dNTP的含量，使PCR容易出錯(cuò)，達(dá)到隨機(jī)突變的目的。2.DNA改組用DNAaseI

先將一個(gè)DNA片段消化成許多小片段，然后不加引物進(jìn)行PCR，使得消化后DNA小段之間重新按多種組合方式連接重組，然后利用原來整片段DNA兩端的引物進(jìn)行加引物的PCR擴(kuò)增，以便得到一系列改組后的突變DNA序列。3.體外隨機(jī)引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，隨機(jī)引物擴(kuò)增，將產(chǎn)生大量與模板不同位點(diǎn)互補(bǔ)的短的DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中會(huì)存在一些點(diǎn)突變。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例胰島素枯草桿菌蛋白酶金屬硫蛋白抗體1.胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRR

KSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NCB肽C肽A肽信號(hào)肽酶信號(hào)肽胰島素的改建工程速效胰島素：SerB9Asp/ThrB27Glu，有利于降低胰島素的締合作用，進(jìn)入血液的吸收率比天然胰島素提高了3倍。長(zhǎng)效胰島素：AsnA21Gly/ThrB27Arg/ThrB30Thr酰胺，半衰期最長(zhǎng)，達(dá)到35.5小時(shí)。高效胰島素：HisB10Asp,活力是天然胰島素的11.7倍?？贵w抗體是一類免疫球蛋白IgG基本結(jié)構(gòu)

重鏈（heavychain，H）輕鏈（lightchain，L）

可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）恒定區(qū)（co