第二章分子克隆工具酶

第二章分子克隆工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對(duì)野生菌株（或真核生物如酵母）進(jìn)行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。分子克隆工具酶工具酶

核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA及RNA修飾酶單鏈核酸內(nèi)切酶酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針；2合成cDNA第二鏈；3填補(bǔ)雙鏈DNA3`凹端；4DNA測(cè)序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng)，合成cDNA或制探針磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY1限制性內(nèi)切酶1.1引言--核酸酶和限制性核酸內(nèi)切酶的定義1.2限制性核酸內(nèi)切酶的命名1.3限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.4限制性核酸內(nèi)切酶活性及其影響因素核酸酶（Nuclease）：通過(guò)切割相鄰兩個(gè)核苷酸殘基之間磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。1）按作用對(duì)象可分為:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)2）按水解斷裂核酸分子不同方式可分為：Endonuclease&Exonuclease1.1引言--核酸酶和限制性核酸內(nèi)切酶的定義限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。

限制酶天然存在于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationSystem)。EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)

若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。1.2限制性核酸內(nèi)切酶的命名1.3限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶1.3.2Ⅱ

型限制性內(nèi)切酶1.3.3Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，沒有固定切割位點(diǎn)（隨機(jī)性）；應(yīng)用：不常用。1.3.2Ⅲ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；特異切割，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外，距識(shí)別位點(diǎn)3`端24-26bp處。應(yīng)用：數(shù)量很少，分子克隆中無(wú)實(shí)際作用。1.3.3Ⅱ型限制性內(nèi)切酶功能：識(shí)別并特異切割DNA分子。

即通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶；反應(yīng)特點(diǎn)：僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，能識(shí)別雙鏈DNA的特殊序列，并可特異切割DNA，產(chǎn)生特異性的片段；應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最常用的內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶限制酶限制性內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。作用特點(diǎn)：特異性，即識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對(duì)）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶EcoRI能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫做黏性末端。(1)基本特性識(shí)別長(zhǎng)度為4-8個(gè)核苷酸的特異序列；最常見的為6個(gè)堿基.許多識(shí)別序列具回文結(jié)構(gòu)，如HindⅢ的識(shí)別序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產(chǎn)生的末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)

和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)PstⅠ切割后產(chǎn)生3ˊ粘性末端：有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端或鈍端（Bluntend）,如SmaⅠ：EnzymeRecognitionsequenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPst

ICTGCA↓GBgl

IIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy

↓PuACSfi

IGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSma

ICCC↓GGGKpn

IGGTAC↓CXba

IT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXho

IC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofselectedRestrictionEndonucleases

(2)同裂酶（isoschizomer）

識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。①同序同切酶

這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同

HindⅡ與HincⅡ識(shí)別切割位點(diǎn)為GTY↓RAC

，HpaⅡ與HapⅡ識(shí)別切割位點(diǎn)為C↓CGGMobⅠ與Sau3AⅠ識(shí)別切割位點(diǎn)為↓GATC

。②同序異切酶

KpnⅠ和Acc65Ⅰ識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。

③“同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)為G↓AATTC，ApoⅠ

識(shí)別和切割位點(diǎn)為R↓AATTY，后者可識(shí)別前者的序列。

④其它有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在pUC

系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè)SalⅠ位點(diǎn)（識(shí)別切割位點(diǎn)為G↓TCGAC），該位點(diǎn)也可被AccⅠ（識(shí)別切割位點(diǎn)為GT↓MKAC）和HincⅡ（識(shí)別切割位點(diǎn)為

GTY↓RAC）切割。(3)同尾酶有些限制酶識(shí)別序列不同，但是產(chǎn)生相同的粘性末端，這些酶稱為同尾酶（isocaudamer)

如：

BamHI:G↓GATCC

Bgl

II:A↓GATC

BclⅠ:5’-T↓

GATCA-31.4

限制性核酸內(nèi)切酶活性

及其影響因素(1)

活性大?。好笇?duì)DNA水解程度不同。(2)酶的活性單位：在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時(shí)消化1μg的λDNA的酶量為1單位。(3)限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件1)底物DNADNA純度:RNA與E結(jié)合影響有效酶濃度；

DNA濃度:

[DNA]過(guò)大，抑制酶活，影響酶分子擴(kuò)散如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

2)反應(yīng)系統(tǒng)因素緩沖液（無(wú)菌、無(wú)污染）buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)

NaCL（0,500,1000mM）金屬離子如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）則特異性改變。離子濃度不合適會(huì)抑制酶活。牛血清蛋白(BSA)BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過(guò)量BSA會(huì)引起電泳拖尾限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)體系Buffer（10x）3LDNA（質(zhì)粒、載體、總DNA….0.1-1g酶2uddH2OBSA（1%）3L30L酶量不超過(guò)總體積的1/10思考題用限制酶BglⅡ消化2ｕgλDNA，該DNA濃度為125ｕg/mL，BglⅡ?yàn)?units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的緩沖鹽體系。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一最佳方案來(lái)完成該實(shí)驗(yàn)限制性內(nèi)切酶的選擇原則：選常見的、活性高的酶，如果雙酶切最好選有公用Buffer的酶推薦酶：Promega公司，Takara公司，Tyoyobo公司雙酶切A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer切）B兩種酶反應(yīng)溫度不同的。（先切其中一個(gè)然后高溫失活，再用另外一個(gè)酶切）C無(wú)公用Buffer的：先用低鹽Buffer切幾個(gè)小時(shí)，再補(bǔ)加鹽分到高鹽加入另外一個(gè)酶繼續(xù)切3.星活性在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性,如EcoRⅠ星活性用EcoRⅠ*表示。

影響因素：甘油濃度高（>5%），酶過(guò)量（>100U/ml），離子強(qiáng)度低（<25mM），pH值過(guò)高（>8.0），45%聚乙二醇(PEG)，有機(jī)溶劑，8%二甲基亞楓，二價(jià)陽(yáng)離子，12%乙醇。限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件DNA末段的長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響需要在識(shí)別序列兩端存在一定長(zhǎng)度的非識(shí)別序列增加切割效率

位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。1.5

限制酶的用途

1.

在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制片斷

2.

建立限制酶（物理）圖譜繪制

3.

構(gòu)建基因文庫(kù)

4.用限制酶切出相同的粘性末端，以便重組2DNA連接酶2.1定義及功能2.2種類及作用機(jī)理2.3使用時(shí)的注意事項(xiàng)2.1定義及功能DNA連接酶（DNAligase）：可使一段DNA的3`羥基末端和5`磷酸末端形成3`，5`-磷酸二酯鍵，把兩個(gè)DNA片段連在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口的酶。

DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。J:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\連接酶\DNA連接酶.J:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\連接酶\連接酶.swfOHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase

連接缺刻(nick)DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。T4DNA連接酶(ATP提供能量）和大腸桿菌DNA連接酶（NAD+提供能量）兩種。2.2種類及作用機(jī)理大腸桿菌的DNA連接酶

大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對(duì)胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應(yīng)形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進(jìn)磷酸二酯鍵的形成。大腸桿菌的DNA連接酶DNA連接酶在大腸桿菌細(xì)胞中約有300個(gè)分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數(shù)相近，這也是比較合理的現(xiàn)象。因?yàn)镈NA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后,封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進(jìn)行DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。

噬菌體T4DNA連接酶

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過(guò)程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率，而對(duì)T4DNA連接酶則無(wú)效。無(wú)論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。

AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶T4DNAligase

的作用機(jī)理1)DNA連接酶不能催化兩單鏈DNA分子連接；2)只能連接雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；3)不能連接雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所致的缺口（gap）。2.3使用時(shí)的注意事項(xiàng)思考

要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。

如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就可以合成重組的DNA分子了。DNA聚合酶（DNApolymerase）

J:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.movJ

J:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.mov3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆轉(zhuǎn)錄酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶3.1DNA聚合酶I活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對(duì)雙鏈DNA，當(dāng)有dNTP存在時(shí)，3`→5`降解活性會(huì)被5`→3`方向的聚合活性所抑制。應(yīng)用：缺口平移法制備DNA分子雜交探針1、5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶I的三種活性DNA雜交探針的制備5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個(gè)核苷酸(d)polⅠ將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(fù)(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動(dòng)，形成32P標(biāo)記的核苷酸合成的DNA鏈制備高比活性的探針當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3‘羥基末端。同時(shí)該酶具有從5’→3‘的核酸外切酶活性,能從切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3‘端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小Ｗ詈线m的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。DNA聚合酶I在基因工程的應(yīng)用用于分子克隆（填充缺口利于重組）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口區(qū)（Gappedregion）→以便有效在體外用于DNA分子重組

DNA序列分析K:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\核酸特性、合成及轉(zhuǎn)運(yùn)\DNA測(cè)序

①

Sauger雙脫氧法

DNApolⅠ參入了2’3’－雙脫氧核苷酸到相應(yīng)的融合了的引物中，從而終止了鏈的進(jìn)一步延伸，這樣每個(gè)大小不同片段都帶有ddNTP。經(jīng)過(guò)PAGE測(cè)出DNA順序。

②

化學(xué)降解法當(dāng)Mg2＋被Mn2＋取代時(shí)，DNApolⅠ有參與相應(yīng)NTP取代dNTP的能力，參與的這個(gè)NTP可以作為1個(gè)特殊切割位點(diǎn)而被降解，得到帶有NTP末端的DNA片段，這是化學(xué)法測(cè)序的主要原理。③

加減法主要原理是在限制使用dNTP條件下加入DNApolⅠ和T4誘導(dǎo)的DNApol同時(shí)反應(yīng)。在減法反應(yīng)中從4個(gè)反應(yīng)混合物中每4個(gè)dNTP中減去1個(gè)。生長(zhǎng)鏈沿著引物延伸至缺少的那個(gè)dNTP為止。在加法反應(yīng)中所用的dNTP只有1種，如dATP，通過(guò)DNApol3′→5′外切酶活性使鏈終止在帶有A的3’末端用其它3種dNTP進(jìn)行類似反應(yīng)，這樣通過(guò)加或減法8個(gè)混合物的電泳結(jié)果即可推出DNA鏈的順序。

來(lái)源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.19703.2Klenow聚合酶DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端(76kd)+N端（36kd）

5’→3’外切用途填補(bǔ)限制酶的5′-粘性末端為平齊末端5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’3’…GGAATT5’Klenow3′-末端標(biāo)記

Klenow

在無(wú)底物時(shí)只進(jìn)行3′→5′外切；有底物存在時(shí)則聚合。這種標(biāo)記也稱作交換標(biāo)記，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。顯著特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性

70℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的40%。應(yīng)用：（1）DNA序列測(cè)定（2）PCR(polymerasechainreaction)對(duì)DNA的特定片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。K:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\分子\PCR3.3TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)：又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶?；钚裕?/p>

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。K:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\逆轉(zhuǎn)錄酶\逆轉(zhuǎn)錄酶的作用原理.swfK:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\逆轉(zhuǎn)錄酶\DNA端部處理K:\生物視頻\細(xì)胞生物學(xué)視頻\反轉(zhuǎn)錄病毒\Life_Cycle_of_a_Retrovirus.mov3.4逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性

用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對(duì)有5`突出末端的DNA片段作末端標(biāo)記（補(bǔ)平）；（3）雙脫氧法測(cè)序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針。活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈DNA強(qiáng)。

高濃度dNTP

環(huán)竟下前者活性更強(qiáng)。應(yīng)用：標(biāo)記DNA平末端或隱蔽3`末端注意：3`外切酶活性無(wú)序列特異性3.5T4DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性，但無(wú)5`→3`外切酶活性；特點(diǎn)：極佳的連續(xù)合成能力應(yīng)用：（1）用于長(zhǎng)模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過(guò)單純的延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA3`末端；（3）使雙鏈DNA的5`或3`突出末端變成平末端。3.6T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶（測(cè)序酶）來(lái)源：T7Phage感染的E.coli結(jié)構(gòu)：由2個(gè)蛋白亞基組成：

T7phagegene5蛋白+宿主硫氧蛋白活性：5′→3′聚合，持續(xù)反