第十章免疫分析技術(shù)

醫(yī)學(xué)檢驗教研室宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院第十章

免疫分析技術(shù)和相關(guān)儀器學(xué)習(xí)要求

掌握臨床免疫檢驗常用儀器的特點;熟悉臨床免疫檢驗常用儀器的分析原理;

了解臨床免疫檢驗常用儀器的使用與維護。主要內(nèi)容

酶免疫分析儀

發(fā)光免疫分析儀放射免疫分儀析儀免疫濁度分析儀時間分辨熒光免疫分析儀第一節(jié)酶免疫分析儀第一節(jié)一、酶免疫技術(shù)的分類

二、酶免疫分析儀的類型、工作原理及結(jié)構(gòu)

三、酶免疫分析儀的性能評價及維護保養(yǎng)四、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標記物，可分為:

酶擴大免疫測定非均相酶免疫測定克隆酶供體免疫測定液相酶免疫法均相酶免疫測定固相酶免疫法(ELISA）

一、酶免疫技術(shù)的分類基本概念二、酶免疫分析儀的類型、工作原理及基本結(jié)構(gòu)酶標儀一般簡單的酶標儀只有讀數(shù)、數(shù)據(jù)處理的功能，還需要配置孵育箱，洗板機，人工操作步驟繁瑣。

全自動酶聯(lián)免疫系統(tǒng)集加樣品、加試劑、孵育、震蕩、洗板和酶標儀功能于一體。

（一）酶免疫分析儀的類型-1微孔板固相酶免疫測定儀器(酶標儀)半自動微孔板ELISA分析儀全自動微孔板ELISA分析儀管式固相酶免疫測定儀器小珠固相酶免疫測定儀器磁微粒固相酶免疫測定儀器等

（一）酶免疫分析儀的類型-21.微孔板固相酶免疫測定儀器(酶標儀)

有單通道和多通道兩種類型工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計相同和不同之處在于：比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通過待測液

酶標儀的工作原理圖2.自動化酶免疫分析系統(tǒng)在酶標儀的基礎(chǔ)上再加上配置:

加樣系統(tǒng)溫育系統(tǒng)洗板系統(tǒng)判讀系統(tǒng)機械臂系統(tǒng)液路動力系統(tǒng)軟件控制系統(tǒng)

系統(tǒng)優(yōu)勢-1自動化程度高：前后處理一體化設(shè)計，減少人與樣品的接觸機會，降低污染。能進行各種自動安全檢測。穩(wěn)定：只要避免人為操作錯誤，可連續(xù)數(shù)年良好工作。準確：不存在交叉污染，確保結(jié)果準確。

系統(tǒng)優(yōu)勢-2高速：加注、讀板速度快擴展性：軟件可升級，樣本量增加，可聯(lián)機使用用戶做主更多：開放式試劑；WINDOW操作系統(tǒng)；中/英/日自選操作界面；自定義編程；自動/自定義時間表；無限存檔。三、酶免疫分析儀的性能評價及維護保養(yǎng)（一）性能評價1．濾光片波長精度檢查及其峰值測定；2．靈敏度和準確度；3．通道差與孔間差檢測；4．零點漂移；5．精密度評價；6．線性測定；7．雙波長評價；三、酶免疫分析儀的性能評價及維護保養(yǎng)（二）維護保養(yǎng)重點：光學(xué)部分

1．濾光片波長精度檢查

2．通道差與孔間差檢測四、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用１.病原體及其抗體的檢測

2.各種免疫球蛋白和細胞因子、補體

3.腫瘤標志物

4.多種激素

5.藥物和毒品等。第二節(jié)發(fā)光免疫分析儀

將發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析方法采用微量倍增技術(shù)，敏感性度，特異性好，所用試劑安全、穩(wěn)定；檢測范圍廣泛，從傳統(tǒng)的蛋白、激素、酶乃至藥物均可檢測發(fā)展迅速，各種儀器不斷出現(xiàn)，自動化程度越來越高。一、發(fā)光免疫的分類-1酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光：吖啶酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)三價鐵-魯米諾系統(tǒng)閃光（Flash）發(fā)光時間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進樣(InSituInjector)和時間積分法測量輝光（Glow）

發(fā)光時間在數(shù)十分鐘以上，如：

-HRP-Luminol系統(tǒng)

-AP-AMPPD系統(tǒng)

-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無須原位進樣、以速率法測量。按發(fā)光持續(xù)時間一.發(fā)光免疫的分類-2時間發(fā)光信號輝光坪區(qū)速率法測量原位進樣積分法測量閃光尖峰閃光-輝光測量方式差別消除放射性危害無半衰期限制，試劑穩(wěn)定性、有效期延長實現(xiàn)連續(xù)、動態(tài)、重復(fù)測定優(yōu)越性-1閃光-輝光測量方式差別適合于復(fù)合標記系統(tǒng)多指標測定操作簡單，反應(yīng)快，易實現(xiàn)自動化靈敏度和線性范圍超過以往技術(shù)優(yōu)越性-2閃光-輝光測量方式差別三.發(fā)光免疫技術(shù)分類根據(jù)示蹤物檢測的不同而分為：熒光免疫測定電化學(xué)發(fā)光免疫測定化學(xué)發(fā)光免疫---再根據(jù)標記物的不同又分：

-化學(xué)發(fā)光免疫分析

-微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析

-電化學(xué)發(fā)光免疫分析

-化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

-生物發(fā)光免疫分析臨床以前三者較為常用。三.發(fā)光免疫分析的基本測定方法根據(jù)發(fā)光反應(yīng)檢測方式的不同可分為

1．液相法反應(yīng)在液相中進行，經(jīng)離心或分離措施后，再進行測定發(fā)光強度

2．固相法將抗原抗體復(fù)合物結(jié)合在固相載體(如聚苯乙烯管)或分離介質(zhì)上(如磁性微粒球等)，再進行測定發(fā)光強度

3．均相法同均相酶免疫法，不需要經(jīng)過離心或分離步驟，即可直接進行發(fā)光強度檢測夾心法特點分析靈敏度（最低檢測限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：

測定誤差（變異）≤20%的最低可檢測濃度。線性范圍：

功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測濃度。相關(guān)系數(shù)：≥0.99的曲線范圍。四、發(fā)光免疫分析儀的種類、工作原理和基本結(jié)構(gòu)(一)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的免疫分析系統(tǒng)(一)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1．儀器測定原理

該類分析技術(shù)有兩種方法：-競爭法測定小分子抗原物質(zhì)-夾心法測定大分子抗原物質(zhì)競爭法特點分析靈敏度（最低檢測限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：

（變異）≤20%的最低可檢測濃度。線性范圍：

功能靈敏度-變異≤20%的最高檢測濃度。相關(guān)系數(shù)：≥0.99的曲線范圍。(一)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)一般由主機和微機兩部分組成：（1）主機部分：包括原材料配備部分：反應(yīng)杯、樣品盤、試劑盤、純凈水、清洗液、廢水在機器上的貯存和處理裝置。液路部分：過濾器、密封圈、真空泵、管道、樣品及試劑探針。機械傳動部分：傳感器、運輸軌道。光路檢測部分：光電倍增管和線路控制板。2．儀器組成全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)66IMMUNOLOGY(一)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)2．儀器組成（2）微機系統(tǒng)程控操作指示判定數(shù)據(jù)處理故障診斷自動監(jiān)視（二)全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

采用微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù)對人體內(nèi)的微量物質(zhì)以及藥物濃度進行定量測定具有高度的特異性、高度的敏感性和高度的穩(wěn)定性等特點全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1.分析方法采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為發(fā)光劑，擴大測定的范圍。以免疫測定方法為基礎(chǔ)：

-競爭法

-夾心法

-抗體檢測等

2.分析過程抗原抗體結(jié)合；加入堿性磷酸酶標記的抗體；形成固相包被復(fù)合物；在電磁場中進行2~3次洗滌分離；加入底物；通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強度；在標準曲線上計算出待測抗原的濃度。3.儀器組成微電腦控制樣品處理系統(tǒng)實驗運行系統(tǒng)中心供給和控制系統(tǒng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在新一代實驗室免疫檢測技術(shù)中很有特點，它在20世紀如年代一問世就引起廣泛的關(guān)注德國公司在鏈酶親和素—生物素包被技術(shù)基礎(chǔ)上，引用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)并開發(fā)出相應(yīng)的全自動電化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)1.測定原理及過程待測標本與包被了抗體的順磁性微粒和發(fā)光劑標記的抗體共同溫育（形成磁性微珠包被抗體—抗原—發(fā)光劑標記抗體復(fù)合物）吸人流動室，緩沖液沖洗磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被電極下的磁鐵吸引，而游離的發(fā)光劑標記抗體被沖洗走

同時在電極加電壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使發(fā)光試劑標記物三氯聯(lián)吡啶釘[Ru(bpy)3]2+TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光光的強度與待測抗原的濃度成正比2.儀器組成及特點由樣品盤、試劑盒、溫育反應(yīng)盤、電化學(xué)檢測系統(tǒng)及計算機控制系統(tǒng)組成應(yīng)用三種抗原抗體反應(yīng)方法：

-抑制免疫法檢測小分子量蛋白抗原

-夾心免疫法檢測大分子量物質(zhì)

-橋聯(lián)免疫法檢測抗體如IgG、IgM

另：釘標記用于DNA／RNA探針分析主要應(yīng)用于以下幾方面檢測：1．甲狀腺系統(tǒng)2．性腺系統(tǒng)3．血液系統(tǒng)4．腫瘤標記物5．心血管系統(tǒng)6．血藥濃度7．感染性疾病8．其他檢測（Ig、血清皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、尿游離脫氧吡啶等）第三節(jié)放射免疫分析儀

放射性核素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合放射免疫技術(shù)主要包括：

-放射免疫分析(,RIA)-免疫放射分析或免疫放射度量分析(IRMA)一、放射性核素的種類特點和檢測儀的基本結(jié)構(gòu)（一）放射性核素的種類和特點

放射性核素依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍及γ計數(shù)器測定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、57Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用一、放射性核素的種類特點和檢測儀的基本結(jié)構(gòu)（二）檢測的基本結(jié)構(gòu)及其探測原理將射線（放射能）與閃爍體的作用轉(zhuǎn)換成光脈沖（光能），然后用光電倍增管將光脈沖轉(zhuǎn)換成電脈沖（電能）。電脈沖在單位時間內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)（即儀器記錄的cmp值）反映了發(fā)出射線的頻率電脈沖的電壓幅度則反映了射線能量的高低。二、晶體閃爍計數(shù)器組成和工作原理（一）儀器組成及工作原理

1．閃爍體

2．光電倍增管

（1）光陰極（2）打拿極（3）陽極

3．多道脈沖分析器

多道分析器（MCA）是進行能譜分析的重要儀器?，F(xiàn)代的MCA與通用微型計算機有許多共同特性，是現(xiàn)代核探測分析及放射影像裝置的重要組成部分。（二）γ-輻射計數(shù)器整機可分為：采樣部分---探頭、換樣裝置、高低壓電源、放大器及單道組成數(shù)據(jù)處理部分---接口、計算機、輸入輸出裝置三.放射免疫分析儀的應(yīng)用常用于測定：激素微量蛋白質(zhì)腫瘤標志物藥物第四節(jié)免疫比濁分析儀

現(xiàn)在臨床上測定微量蛋白(如Ig等)已發(fā)展到現(xiàn)代自動免疫分析技術(shù)，其靈敏度逐步提高，檢測水平由微克到納克，甚至皮克水平。

微量蛋白免疫分析隨著自動化程度不斷提高，在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其自動化檢測方法主要為免疫比濁法免疫比濁法免疫透射濁度測定法免疫透射比濁法免疫膠乳濁度測定法

終點散射比濁法免疫散射比濁法

速率散射比濁法

光路示意圖如下：免疫分析比濁技術(shù)的主要優(yōu)勢(1)穩(wěn)定性好，敏感性高(2)分析簡便、快速(3)避免標本之間及標本對人的污染(4)標本用量少（一）免疫透射比濁測定免疫透射比濁度測定(turbidimetry)

免疫透射比濁測定免疫膠乳濁度測定光路示意見下圖：1.免疫透射比濁測定原理

抗原抗體在緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當反應(yīng)液中保持抗體過剩時，形成的復(fù)合物隨抗原增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加。2.免疫膠乳濁度測定法原理選擇均勻一致的膠乳顆粒吸附抗體，當遇到相應(yīng)抗原時，發(fā)生凝集；單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過。當兩個膠乳顆粒凝集時，則使透過光減少，減少的程度與膠乳凝聚成正比。（二）激光散射濁度測定激光散射濁度測定(nephelometry)分為：

-終點散射比濁法(endnephelometry)-速率散射比濁法(ratenephelometry)基本原理：激光散射光系沿水平軸照射，碰到抗原—抗體復(fù)合物時，導(dǎo)致光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)0o

～90o，其偏轉(zhuǎn)角度因光線波長、離子大小不同而有所區(qū)別。散射光的強度與抗原-抗體復(fù)合物的含量成正比，和散射夾角成正比，和波長成反比。1.終點散射比濁法

抗原—抗體反應(yīng)達到平衡時（通常為30～60分鐘），復(fù)合物濁度不再受時間的影響，在聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進行濁度測定。散射比濁法是測定抗原與抗體結(jié)合完成后測定其復(fù)合物的量。2.速率散射比濁法

速率是指抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率散射比濁法是在抗原與抗體反應(yīng)的最高峰(約在1分鐘內(nèi))測定其復(fù)合物形成的量，該法具有快速、準確的特點。

3.激光散射濁度測定儀(1)ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)由微電腦控制，可以定量檢測體液中微量蛋白的全自動組合儀器。儀器主要部件（1）散射測濁儀光源采用雙光源碘化硅晶燈泡(400-620nm)；（2）加液系統(tǒng)具有液體感知裝置，控制加液體積的準確性；（3）試劑和樣品盤（4）閱讀器讀取卡片內(nèi)貯存的參數(shù)。

儀器主要特點：

IC懸浮顆粒所產(chǎn)生的散射光速率變化強弱與抗原濃度成正比；速率峰值經(jīng)微電腦處理轉(zhuǎn)換成抗原濃度；測到所需的速率峰值后，儀器通過峰值鑒定程序再對此峰值進行確證；抗原過剩的監(jiān)測在抗原過剩的情況下，儀器重新對標本進行稀釋，然后再次測定；使用抗體、標準血清、抗體卡片和校正卡片。DB100特種蛋白分析測定系統(tǒng)，由分析儀、計算機打印機、條碼讀取器四部分組成。分析儀是該系統(tǒng)的主要部分，包括：（1）散射測濁儀光源采用發(fā)光二極管（2）加液系統(tǒng)（3）支架運輸裝置（4）比色杯裝置儀器主要特點：固定時間測定：利用兩個時間光散射檢測之間的差異，在免疫反應(yīng)混合物預(yù)備10秒鐘測定第一次光散射的值t1)，然后在反應(yīng)6分鐘后測定第二次光散射的值(t2)

終點檢測法：檢測預(yù)溫30分鐘后光散射的值(t1)。通