常見微生物培養(yǎng)檢測技術(shù)

常見微生物培養(yǎng)檢測技術(shù)第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日細(xì)菌培養(yǎng)方式

用人工方法,將細(xì)菌從自然界、動物體或病料中分離出來,研究細(xì)菌的形態(tài)、生理特性、生物學(xué)特性或制取細(xì)菌的某種代謝產(chǎn)物等,這對于傳染病的診斷和防治具有重要意義。根據(jù)不同標(biāo)本及不同培養(yǎng)目的,可選用不同的接種和培養(yǎng)方法。常用的有分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)兩種方法。第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日(一)培養(yǎng)基的種類和常用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的概念：將細(xì)菌所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)按一定比例混合在一起,并調(diào)節(jié)到適宜的PH,這種人工配制的適合細(xì)菌生長繁殖的細(xì)菌營養(yǎng)物,稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制原則：培養(yǎng)基組分應(yīng)適合細(xì)菌的營養(yǎng)特點營養(yǎng)營養(yǎng)協(xié)調(diào)理化條件適宜經(jīng)濟(jì)節(jié)約無菌第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日1.培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基的組成成分分類合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的功能分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基。第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有培養(yǎng)一般細(xì)菌的最基本成分。又分為:液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三種。在液體(肉湯)培養(yǎng)基中,加入2%-3%瓊脂即為固體培養(yǎng)基,加入0.2%-0.5%瓊脂即為半固體培養(yǎng)基。第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入高營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、血液、血清、腹水、生長因子等,以滿足營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長需要有的細(xì)菌還需加入特殊物質(zhì),如結(jié)核桿菌需加入雞蛋清、馬鈴薯、甘油等才能良好生長第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日(3)選擇培養(yǎng)基利用細(xì)菌對某種物質(zhì)敏感程度的不同,可在培養(yǎng)基中加入抑制某些細(xì)菌生長的藥物,而選擇性地讓欲分離的細(xì)菌旺盛生長的培養(yǎng)基,如膽鹽和薔薇色酸可以選擇性地抑制G+菌的生長,而不影響G－菌的生長。在培養(yǎng)基中加入二藥后可選擇性地分離出腸道桿菌。第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日(4)鑒別培養(yǎng)基利用細(xì)菌分解底物及其代謝產(chǎn)物的不同,可在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)和指示劑,即制為鑒別培養(yǎng)基,以測定不同細(xì)菌的生化反應(yīng)。紫黑色,具有金屬光澤的菌落麥康凱平板：紅色菌落第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日(5)厭氣培養(yǎng)基將培養(yǎng)基與空氣及氧隔離,或降低培養(yǎng)基中的氧化還原電勢,供厭氧菌生長。除去培養(yǎng)基中氧的方法：降低培養(yǎng)基中氧化還原電勢：如肝湯或加入谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等?；先パ醴ǎ喝缃剐詻]石子酸、好氧厭氧菌混合、種子發(fā)芽等。隔絕阻氧法：如液體石臘等。第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日(二)細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長特征有關(guān)概念菌落:在固體培養(yǎng)基上,由單個細(xì)胞繁殖形成的肉眼可見的細(xì)菌集落,稱為菌落。菌苔:在固體培養(yǎng)基上,大量菌落密集生長,融合成一片,稱為菌苔。純培養(yǎng):挑取一個菌落到另一培養(yǎng)基桑培養(yǎng),稱為純培養(yǎng)。不同的微生物種類,其菌落特征不同。同一種菌在不同培養(yǎng)條件下菌落特征也不盡相同,細(xì)菌的生長特征有助于細(xì)菌的鑒定。第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日細(xì)菌分離培養(yǎng)形式及培養(yǎng)結(jié)果第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是:肽聚糖(peptidoglycan),又稱為粘肽(mucopeptide)或胞壁質(zhì)(murein)。

丹麥病理學(xué)家革蘭(HansChristianGram)為證實病組織切片中有細(xì)菌存在,在1884年介紹了脫色后再進(jìn)行復(fù)染的鑒別染色法,后來被稱為革蘭染色法革蘭陽性菌G＋(Grampositivebacteria)革蘭陰性菌G－(Gramnegativebacteria)涂片結(jié)晶紫染色碘液媒染酒精脫色復(fù)紅復(fù)染通過革蘭氏染色法可將細(xì)菌分為G＋菌(藍(lán)紫色)和G－菌(紅色)兩大類型。主要區(qū)別在于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同。第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日致病菌的檢驗程序標(biāo)本直接涂片檢查分離培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)(核酸雜交、PCR)生化試驗血清學(xué)試驗動物試驗藥敏試驗其它(HPLC)第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果同一細(xì)菌對不同抗生素的敏感性不同細(xì)菌對相同抗生素的敏感性第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日病毒

病毒(Virus)：是形體微小、結(jié)構(gòu)簡單、僅含有一種核酸（DNA或RNA），能夠通過細(xì)菌濾器,具有超級寄生性（嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生），且必須在電子顯微鏡下才能觀察到的一類非細(xì)胞形微生物。

1892年，伊萬諾夫斯基和貝杰林克，煙草花葉病毒，開創(chuàng)了病毒學(xué)獨立發(fā)展的歷程。第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以透過細(xì)菌濾器只含一種核酸（DNA或RNA）嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生增殖方式為核酸復(fù)制對干擾素敏感，對抗生素不敏感病毒的基本特征第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日（一）病毒的感染病毒與細(xì)胞相互作用稱為病毒的感染。1.溶解性相互作用：病毒增殖,宿主細(xì)胞被破壞或溶解,也可不破壞細(xì)胞,形成穩(wěn)定狀態(tài)感染。2.轉(zhuǎn)化性相互作用：病毒基因組與宿主細(xì)胞基因組整合,引起宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。有些非但抑制宿主細(xì)胞的生物合成,反而促進(jìn)細(xì)胞分裂增生,導(dǎo)致腫瘤或細(xì)胞癌變。病毒的增殖第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日（二）病毒的增殖病毒自身無完整的酶系統(tǒng),不能進(jìn)行獨立的物質(zhì)代謝,必須在活的宿主細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行生活、復(fù)制和增殖由宿主細(xì)胞供應(yīng)原料、能量和生物合成場所,在病毒核酸遺傳密碼的控制下,于宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白質(zhì),進(jìn)一步裝配成大量的子代病毒,并將他們釋放到細(xì)胞外,這種增殖方式稱為復(fù)制第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日病毒的復(fù)制周期（ReplicativeCircle）定義：自病毒吸附于細(xì)胞開始，到子代病毒從感染細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的病毒復(fù)制過程稱為病毒的復(fù)制周期。病毒的復(fù)制增殖過程,大致包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配和釋放六個步驟。第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日

Replicationofvirulentphage第二十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日Lysogenicinfection第二十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日1、吸附需要病毒表面特異性的吸附蛋白(VAP)與細(xì)胞表面受體(也稱為病毒受體)相互作用,是決定感染成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞膜受體有脂蛋白受體和粘蛋白受體兩種,除具有病毒吸附部位外,尚有促進(jìn)病毒感染的作用。病毒的細(xì)胞受體具有種系和組織特異性,決定了病毒的宿主譜。第二十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日2、穿入(侵入)病毒吸附于細(xì)胞膜后,細(xì)胞膜受體和鄰近部位的膜發(fā)生折疊,將病毒吞陷,吞飲于泡內(nèi)(牛痘病毒);或通過病毒與宿主細(xì)胞膜的融合進(jìn)入細(xì)胞漿中(皰疹病毒);無包膜病毒則直接穿過細(xì)胞膜而入細(xì)胞(呼腸孤病毒);第二十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日直接進(jìn)入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞飲(包膜病毒)第二十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日3、脫殼

感染性核酸從衣殼內(nèi)釋放出來的過程。有包膜病毒脫殼包括脫包膜和脫衣殼兩步,無包膜病毒只需脫衣殼,方式隨不同病毒而異。

病毒衣殼的脫落和核酸的逸出,主要在細(xì)胞漿(RNA病毒)或細(xì)胞核(DNA病毒)內(nèi)完成。第二十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日4、生物合成

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后生物合成階段,胞漿中無病毒顆粒,稱為隱蔽期(eclipse)。病毒的生物合成過程分早期和晚期兩個階段：1.早期:主要是由核酸(DNA或RNA)通過mRNA制造酶類蛋白質(zhì)代謝工具和核酸基因組需要的核苷酸原料；2.晚期:主要是通過晚期mRNA合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。第二十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日5、裝配多數(shù)DNA病毒在細(xì)胞核內(nèi)合成裝配,RNA病毒在細(xì)胞漿內(nèi)合成裝配。第三十頁，共三十八頁，2022年，8月28日6、釋放有的病毒聚積在細(xì)胞空泡內(nèi)后通過細(xì)胞通道向外溢出;有的依靠細(xì)胞膨脹破裂放出;有的則因細(xì)胞感染病毒后死亡裂解或自溶而釋出。有囊膜的病毒多數(shù)借出芽而穿出細(xì)胞游離。第三十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日一、動物接種動物選擇標(biāo)準(zhǔn):對病毒的易感性高;動物健康,體重、年齡盡可能一致,最好使用相應(yīng)的等級實驗動物,并符合所要培養(yǎng)病毒的要求;盡量使用遺傳特性相似,個體差異較小,生物學(xué)反應(yīng)比較一致的動物;外購動物,接種前要經(jīng)過健康觀察,以免誤用帶有病原體動物?？筛鶕?jù)病毒性質(zhì)、材料性質(zhì)和目的不同,采取皮下接種法、皮內(nèi)接種、肌肉接種、靜脈接種、腹腔接種法、腦內(nèi)接種法。第三十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日二、禽胚培養(yǎng)理想的禽胚為SPF雞胚。常用非免疫雞胚加以補(bǔ)充,這種蛋應(yīng)無特定病原的母源抗體,否則會影響病毒在胚內(nèi)增殖。此外,不同病原對禽胚的適應(yīng)性也不同,如狂犬病和減蛋綜合征病毒在鴨胚中比雞胚中更易增殖,雞傳染性喉氣管炎病毒只能在雞和火雞胚內(nèi)增殖,實際應(yīng)用時而加以嚴(yán)格選擇。常用的接種途徑有絨毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黃囊法四種,根據(jù)不同的病毒和不同的目的采用適宜的接種途徑。第三十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日絨毛尿囊膜接種(10-13日齡胚)尿囊腔接種(9-11日齡胚)羊膜腔接種(10-12日齡胚)卵黃囊接種(5-8日齡胚)禽胚接種術(shù)式第三十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日雞胚不同接種途徑與收獲比較接種途徑日齡方法破殼部位接種量(ml)收獲尿囊膜10-13開蛋窗及人工氣室或鉆孔絨毛尿囊膜發(fā)育中心及氣室0.05-0.1擴(kuò)大蛋窗、收集接種部絨毛尿囊膜尿囊腔9-11鉆孔胚胎面與氣室交界邊緣上、下約1mm處0.1-0.2破氣室,收集尿囊液(5-8ml)羊膜腔10-12開蛋窗氣室端靠近胚胎側(cè)0.1-0.2擴(kuò)大蛋窗,收集尿囊液及羊水卵黃囊5-8鉆孔氣室中心0.2-0.5破氣室,收集去卵黃的卵黃囊或雞胚體第三十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日影響禽胚病毒增殖的因素1.種蛋質(zhì)量:SPF種蛋最理想,其次是非免蛋,普通種蛋不能用。病原微生物:家禽有很多疫病可經(jīng)垂直傳遞于雞胚,這些病原體既可污染制品本身,又可影響接種病毒在雞胚內(nèi)增殖母源抗體:種蛋帶有母源抗體,影響病毒在雞胚內(nèi)增殖抗生素:家禽混合飼料中常含有一定的抗生素,這種微量的抗生素可以傳遞給蛋胚殘留第三十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日2.孵化技術(shù):適宜的孵化條件有利于病毒增殖溫度:通常適宜溫度為37-39.5℃。寧低勿高。濕度:雞胚孵化標(biāo)準(zhǔn)為53%-57%,水禽胚孵化比雞胚高5%-10%。通風(fēng):發(fā)育過程中吸入氧氣排出二氧化碳,隨胚齡增長需更換孵化機(jī)內(nèi)空氣。轉(zhuǎn)蛋:大頭向上垂直放置入孵,在孵化過程中定期轉(zhuǎn)蛋,使胚胎受熱均勻,防止胚胎與蛋殼粘連3.接種技術(shù):不同病毒的增殖有不同的接種途徑,同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。同時,接種操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,不應(yīng)傷及胚體和血管,以免影響其發(fā)育,使病毒增殖速度降低或停止。第三十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日