紫外可見光譜與熒光光譜

關(guān)于紫外可見光譜與熒光光譜第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日光譜的產(chǎn)生：輻射躍遷－光吸收和光發(fā)射分子的電子光譜：通過光與分子的相互作用，基態(tài)分子吸收光躍遷到電子激發(fā)態(tài)和電子激發(fā)態(tài)發(fā)射光躍遷到基態(tài)的光物理過程吸收光譜發(fā)射光譜（紫外－可見吸收光譜）（熒光光譜、磷光光譜）分子的電子吸收光譜和電子發(fā)射光譜為電子激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)、能學(xué)和動(dòng)態(tài)學(xué)的研究提供了重要的信息第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日（1）光譜的產(chǎn)生光是什么？分子為什么會(huì)/能吸收光？光譜產(chǎn)生的原理第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日?qǐng)D：電磁波（一個(gè)小的有機(jī)分子的“尺寸”比一個(gè)波長要小得多）作為電磁波：可對(duì)帶電粒子（例如電子與核）和磁偶極子（如電子自旋和核自旋）施加電力和磁力光是一種電磁波，可以看成是由在光傳播方向上互相垂直的兩個(gè)平面上相互作用的交變電場(chǎng)與交變磁場(chǎng)組成的。第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日光與分子的相互作用看作是振蕩偶極子（電子）和輻射場(chǎng)（振蕩電場(chǎng)）產(chǎn)生的一種能量交換過程。偶極子理解光與分子相互作用的關(guān)鍵概念是：光的振蕩電場(chǎng)可以使電子運(yùn)動(dòng)，也就是被激發(fā)的電子表現(xiàn)得象是一個(gè)振蕩的偶極子。這種偶極子的振蕩相當(dāng)于化學(xué)鍵中的電子相對(duì)于物質(zhì)中帶正電的原子核的運(yùn)動(dòng)，也就是電子圍繞分子的核骨架振動(dòng)。第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日在分子的電子云中任一給定點(diǎn)，光波引起的電場(chǎng)強(qiáng)度變化將是時(shí)間的函數(shù)即：零→（吸引）最大值→零→（產(chǎn)生一個(gè)相反的場(chǎng)）→（排斥）最大值→零重合（正、負(fù)電中心）分開圖：電場(chǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生偶極矩＋－＋δ＋δ－δ－δε

＝0ε≠0μiμi凈效應(yīng)：瞬時(shí)偶極矩偶極矩第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日光與分子之間的相互作用取決于共振能量：ΔE

ΔE＝hν=hc/λ光子能量：E=hvh:普朗克常數(shù)6.626176×10-34焦耳·秒v:頻率c:光速λ:波長

電子能級(jí)的一個(gè)基本特點(diǎn)：能級(jí)量子化電子的躍遷能級(jí)差約為1~20eV，比分子振動(dòng)能級(jí)差要大幾十倍kT=25meV體系熱能的標(biāo)度E第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日電子躍遷所處的波長范圍（能量）電子躍遷類型：（1）σ→σ*躍遷指處于成鍵軌道上的σ電子吸收光子后被激發(fā)躍遷到σ*反鍵軌道（2）n→σ*躍遷指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸收能量后向σ*反鍵軌道的躍遷（3）π→π*躍遷指不飽和鍵中的π電子吸收光波能量后躍遷到π*反鍵軌道。（4）n→π*躍遷指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸收能量后向π*反鍵軌道的躍遷。第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日（2）光吸收與光發(fā)射光譜相關(guān)的一些基本概念你做過吸收和發(fā)射光譜嗎？你為什么要做吸收和發(fā)射光譜？你理解的吸收和發(fā)射光譜是什么？第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日吸收光譜與測(cè)試

一個(gè)基態(tài)分子M吸收能量為h的一個(gè)光子，使占據(jù)軌道的一個(gè)電子躍遷到空軌道而處于電子激發(fā)態(tài)M*，這種光激發(fā)過程可表示為

M＋hM*

通過吸收光譜的測(cè)定，可以確定與躍遷相關(guān)的兩個(gè)軌道的能級(jí)間隔。

第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日吸收光譜以被吸收的光子的能量(波長、波數(shù)和能量eV)為橫坐標(biāo)，吸光度D或、log為縱坐標(biāo)，給出分子對(duì)具有不同能量光子的吸收特性。被吸收的光子能量等于激發(fā)態(tài)的能量。吸光度被吸收的光子的能量(波長、波數(shù)和能量eV)第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日:摩爾消光系數(shù)。是評(píng)價(jià)物質(zhì)吸收光的能力的重要物理量I0:入射光強(qiáng)度I:透射光強(qiáng)度是分子的一個(gè)基本性質(zhì)，與物質(zhì)的種類和入射光的波長有關(guān),不依賴于濃度和光程長度。其大小與躍遷是否滿足選擇定則密切相關(guān).Lambert定律指出：被透明介質(zhì)所吸收的入射光的百分?jǐn)?shù)與入射光的強(qiáng)度無關(guān)。（激光光源除外）Beer定律指出：被吸收的光的量正比于光程中吸光分子的濃度。Lambert－Beer定律I=I010clA=log(I0/I)=cl（稀溶液）A：吸光值第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日(2)能量吸收光譜通常用吸收光的波長λ(nm)、波數(shù)?(cm1)或光子能量(eV)表示激發(fā)態(tài)能量。波長通常用峰值波長λmax(nm)，有時(shí)也可采用帶邊波長λedge(nm)表示。波長、波數(shù)和eV之間能量換算關(guān)系如下：

?(cm1)=1/λ(cm)=1×107/λ(nm)

E(eV)=1240/λ(nm)OD=log(I0/I)(1)吸光度(absorbance)或光密度(opticaldensity)OD=2=0.011%transmitanceor99%absorbance~98%transmitanceor2%absorbance第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日吸收光譜用峰值的ε值或者用譜帶的積分強(qiáng)度表示吸收強(qiáng)度。用于表示這種積分強(qiáng)度的物理量是振子強(qiáng)度(oscillatorstrength)：

=4.32

109∫d

4.32×109max

1/2

式中max為峰值摩爾消光系數(shù)，1/2為半峰寬。積分吸收強(qiáng)度與描述電子躍遷的基本理論單位振動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)，最大允許的躍遷強(qiáng)度的數(shù)值為1。應(yīng)用這個(gè)方程式可以計(jì)算任何一個(gè)吸收帶的振動(dòng)強(qiáng)度，并且可以將這個(gè)計(jì)算至與1比較，來判斷產(chǎn)生這一能帶的電子躍遷是允許的還是禁阻的。第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日一些基本概念（1）發(fā)色團(tuán)（Chromophoricgroup）：分子中能吸收紫外光或可見光的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)叫做發(fā)色團(tuán)或色基。象C=C、C=O、C≡C等都是發(fā)色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，電子躍遷類型也不同。（2）助色團(tuán)（Auxochromicgroup）：有些原子或基團(tuán)，本身不能吸收光波，但它與一定的發(fā)色團(tuán)相連時(shí)，則可使發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收峰移動(dòng)，這樣的原子或基團(tuán)叫做助色團(tuán)。如：-OH、-NH2、-SH及一些鹵素等。

第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日紅移和藍(lán)移有機(jī)化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強(qiáng)度發(fā)生變化:

λmax向長波方向移動(dòng)稱為紅移，向短波方向移動(dòng)稱為藍(lán)移

(或紫移)。吸收強(qiáng)度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應(yīng)或減色效應(yīng)，如圖所示。第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日吸收光譜的測(cè)定裝置示意圖:光源發(fā)射的多波長連續(xù)光經(jīng)過單色儀分光，按波長順序進(jìn)入樣品池，透過樣品池的透射光用光電倍增管和光子計(jì)數(shù)器測(cè)定強(qiáng)度，用計(jì)算機(jī)控制操作并處理數(shù)據(jù)。在雙光路系統(tǒng)中，一個(gè)光路上為溶劑池，另一個(gè)光路上為樣品池，經(jīng)過單色儀的單色光交替透過兩個(gè)吸收池測(cè)得log(I0/I)隨波長的變化。

吸收光譜儀第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日雙光路分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)P使單色光以從長波到短波波長順序連續(xù)通過出射狹縫(S2)長波區(qū)：鎢燈（340－2500nm）短波區(qū)：氘燈（185－360nm）石英棱鏡反射鏡樣品池參比池光電倍增管（PbS光電池長波）第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)吸收池有石英池和光學(xué)玻璃池，石英池在紫外-可見區(qū)和近紅外區(qū)的透過率很高，可測(cè)紫外-可見吸收光譜和近紅外吸收光譜，光學(xué)玻璃在紫外區(qū)有吸收，不能用來測(cè)定紫外區(qū)吸收光譜。（區(qū)分吸收池）各種有機(jī)溶劑在紫外區(qū)有吸收，吸收端波長(nm)如下：乙腈(190)、水(191)、戊烷(190)、己烷(195)、異辛烷(197)、環(huán)己烷(198)、甲醇(203)、乙醇(204)、乙醚(215)、二氯甲烷(230)、四氫呋喃(235)、氯仿(245)、乙酸(251)、乙酸乙酯(254)、四氯化碳(266)、DMF(270)、苯(278)、甲苯(285)、四氯乙烯(290)、吡啶(305)、二硫化碳(380)和CH3NO2(380)。這些吸收帶的長波區(qū)是溶劑透過光的可利用的光譜區(qū)。溶劑的極性對(duì)于吸收帶的位置產(chǎn)生影響。（純化溶劑）第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日光致電子激發(fā)態(tài)是很活潑的可以經(jīng)過分子內(nèi)輻射與無輻射躍遷回到基態(tài)，還可以與猝滅劑進(jìn)行分子間能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移和化學(xué)反應(yīng)而猝滅。

？發(fā)射光譜與測(cè)試第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日熒光光譜法基本原理

分子的激發(fā)與失活分子的多重態(tài)單重態(tài)：

一個(gè)所有電子自旋都配對(duì)的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高能級(jí)，其自旋方向不會(huì)立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。三重態(tài)：

有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日J(rèn)ablonskidiagram發(fā)射光譜磷光光譜熒光光譜無輻射躍遷☆振動(dòng)弛豫：☆內(nèi)轉(zhuǎn)換：☆系間竄越：☆外轉(zhuǎn)換：熒光磷光第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日熒光光譜有熒光發(fā)射譜和熒光激發(fā)譜測(cè)定熒光發(fā)射譜時(shí)，利用激發(fā)單色儀固定激發(fā)光的波長ex，這時(shí)只有具有ex波長的光子進(jìn)入樣品池，使基態(tài)分子M處于M*。M*發(fā)射的光用發(fā)射單色儀分光，給出發(fā)射光的強(qiáng)度隨波長變化曲線。測(cè)定熒光激發(fā)譜時(shí)，選擇發(fā)射譜中的某個(gè)發(fā)射波長em作為觀測(cè)波長,測(cè)定不同波長的激發(fā)光對(duì)發(fā)射觀測(cè)波長的貢獻(xiàn)。發(fā)射光熒光光譜儀第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光光譜的特點(diǎn)：①斯托克斯位移（Stokesshift)。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；②熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用λ=250和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；③吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對(duì)稱。Em：

ex＋20——2ex－20Ex：em/2＋20——em－20第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日（3）吸收光譜和發(fā)射光譜的形狀ΔE＝hν你所見到的吸收光譜和發(fā)射光譜:“銳線”?為什么不是與吸收的光或發(fā)射的光的頻率有關(guān)的“銳線”?第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日AbsEmA原子B具有分立的支態(tài)的分子C具有不可分辨的支態(tài)的分子銳線光譜帶振動(dòng)結(jié)構(gòu)寬帶光譜低壓氣相原子低壓氣相剛性分子溶劑分子典型例子第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日紫外吸收光譜的應(yīng)用

物質(zhì)的紫外吸收光譜基本上是其分子中生色團(tuán)及助色團(tuán)的特征，而不是整個(gè)分子的特征。如果物質(zhì)組成的變化不影響生色團(tuán)和助色團(tuán)，就不會(huì)顯著地影響其吸收光譜，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光譜。另外，外界因素如溶劑的改變也會(huì)影響吸收光譜，在極性溶劑中某些化合物吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)會(huì)消失，成為一個(gè)寬帶。所以，只根據(jù)紫外光譜是不能完全確定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，還必須與紅外吸收光譜、核磁共振波譜、質(zhì)譜以及其他化學(xué)、物理方法共同配合才能得出可靠的結(jié)論。第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日1化合物的初步鑒定

利用紫外光譜可以推導(dǎo)有機(jī)化合物的分子骨架中是否含有共軛結(jié)構(gòu)體系，如C＝C－C＝C、C＝C－C＝O、苯環(huán)等。利用紫外光譜鑒定有機(jī)化合物遠(yuǎn)不如利用紅外光譜有效，因?yàn)楹芏嗷衔镌谧贤鉀]有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光譜一般比較簡(jiǎn)單，特征性不強(qiáng)。利用紫外光譜可以用來檢驗(yàn)一些具有大的共軛體系或發(fā)色官能團(tuán)的化合物，可以作為其他鑒定方法的補(bǔ)充。

第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日如果一個(gè)化合物在紫外區(qū)是透明的，則說明分子中不存在共軛體系，不含有醛基、酮基或溴和碘?？赡苁侵咀逄?xì)浠衔?、胺、腈、醇等不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系的化合物。如果在210～250nm有強(qiáng)吸收，則可能含有兩個(gè)雙鍵的共軛體系，如共軛二烯或α，β-不飽和酮等。同樣在260，300，330nm處有高強(qiáng)度吸收帶，在表示有三個(gè)、四個(gè)和五個(gè)共軛體系存在。如果在260～300nm有中強(qiáng)吸收（ε＝200～1000），則表示體系中可能有苯環(huán)存在。如果苯環(huán)上有共軛的生色基團(tuán)存在時(shí)，則ε可以大于10000。如果在250～300nm有弱吸收帶則可能含有簡(jiǎn)單的非共軛并含有n電子的生色基團(tuán)，如羰基等。

第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日2純度檢測(cè)

如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。

第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日在相同條件下配制樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳波長λ最佳處測(cè)得二者的吸光度A樣和A標(biāo)，進(jìn)行比較，按式計(jì)算樣品溶液中被測(cè)組分的濃度。2.1比較法第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在λ最佳處分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在完全相同的條件下測(cè)定試液的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試液的濃度。該法適用于大批量樣品的測(cè)定。

第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日3定量分析

朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律是紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)，它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

A=εlc第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日4氫鍵強(qiáng)度的測(cè)定

溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時(shí)，對(duì)溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對(duì)于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測(cè)定氫鍵的強(qiáng)度。溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時(shí)，對(duì)溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對(duì)于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測(cè)定氫鍵的強(qiáng)度。

第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日紫外/可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用濃度測(cè)定

構(gòu)象變化研究

相互作用研究第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在<250nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)濃度測(cè)定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶劑吸收也較大第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日溶劑的吸收第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250nm附近有弱吸收色氨酸酪氨酸苯丙氨酸第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)

ProtParam:第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日Tyr的吸收譜與pH有關(guān)pHtitrationcanbeusedtodetermine

-whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25oC(bold);-HelixatpH10.8,25oC(dotted);-strandatpH10.8,52oC(dashed).第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)折疊/變性研究核糖核酸酶第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日熒光法的應(yīng)用熒光法靈敏度高，檢測(cè)限比吸收光譜法低1~3個(gè)數(shù)量級(jí)，可用于痕量分析。選擇性好，由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多。線性范圍寬。應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)

第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日Trpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponseto

conformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,

andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquely

sensitivetocollisionalquenching,

eitherby

externallyaddedquenchers,orby

nearbygroupsintheprotein.第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日FluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylarge第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日序號(hào)儀器名稱購置日期單價(jià)管理者銷售商運(yùn)行狀況配件維修記錄205301熒光2004.11178200.00吳曉霞島津沈陽好恒溫水浴無21紫外分光光度計(jì)2000.12113781.00吳曉霞島津沈陽好無22P-750熒光2000.12117943.00吳曉霞日本分光041182364123換工作站無232550紫外2004.11341550.00吳曉霞島津沈陽好半導(dǎo)體元件242550紫外2007.1168000.00吳曉霞島津沈陽好恒溫水浴無251700紫外2004.11吳曉霞島津沈陽好無261700紫外2004.11吳曉霞島津沈陽好無儀器的操作方法第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日一、開機(jī)前準(zhǔn)備

1．實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)保持在15℃~30℃之間，相對(duì)濕度應(yīng)保持在45%~80%之間。

2．確認(rèn)樣品室內(nèi)無樣品。

二、開機(jī)

1．開啟總電源及UV-2550電源。

2．開啟計(jì)算機(jī)電源，雙擊桌面上的UVProbe圖標(biāo)進(jìn)入操作系統(tǒng)。

3．在UVProbe界面上點(diǎn)擊[Connect]鍵，聯(lián)機(jī)并初始化。整個(gè)過程需花4~5分鐘。（電源再次打開時(shí)，需隔10分鐘或更長的時(shí)間。）SHIMADZUUV-2550型紫外可見分光光度儀操作規(guī)程第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日三、操作過程

1．在主菜單上選擇測(cè)定的方式：

（1）點(diǎn)擊[Kinetics]鍵進(jìn)入動(dòng)力學(xué)測(cè)定方式：一般測(cè)定吸收值隨時(shí)間的變化，通常用于酶反應(yīng)隨時(shí)間的變化。

（2）點(diǎn)擊[Spectrum]鍵進(jìn)入光譜測(cè)定方式：可進(jìn)行紫外可見近紅外區(qū)的光譜測(cè)定。（3）點(diǎn)擊[Photometric]鍵進(jìn)入光度測(cè)定（定量）方式：可進(jìn)行多波長、單波長、峰高定量。校準(zhǔn)曲線可使用多點(diǎn)、單點(diǎn)、K因子等方法。

第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日2．參數(shù)的設(shè)定：點(diǎn)擊菜單欄上的[M]鍵，點(diǎn)擊［Measurement］標(biāo)簽，根據(jù)提示在對(duì)話框中選擇波長測(cè)定范圍、掃描速度、采樣間隔等參數(shù)；點(diǎn)擊［InstrumentParameters］標(biāo)簽，選擇測(cè)定種類（吸收值、透射能量、反射率）及通帶（狹縫）等條件。

3．基線校正：所有參數(shù)設(shè)置完成后，兩個(gè)樣品架均不放置樣品或兩個(gè)均放上同樣的空白溶液，點(diǎn)擊“Baseline”，開始進(jìn)行基線校正，儀器掃描完成后，點(diǎn)擊“λGoToWL”將波長轉(zhuǎn)到800nm，點(diǎn)擊“AutoZero”把800nm的波長設(shè)為0。點(diǎn)擊“Start”再次掃描，若得出曲線值均小于0.001，則認(rèn)為基線平坦，若數(shù)值較大，則將800nm吸光度設(shè)為0重新進(jìn)行基線掃描。

4．樣品測(cè)定：樣品放入樣品室后，點(diǎn)擊[Start]鍵即開始測(cè)定。完成后，取一個(gè)文件名并保存。第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日四、報(bào)告輸出

點(diǎn)擊菜單欄上的[Report]鍵，根據(jù)需要選擇報(bào)告格式。點(diǎn)擊菜單欄上的[Printpreview]鍵預(yù)覽，點(diǎn)擊菜單欄上的[Print]鍵，輸出報(bào)告。

五、關(guān)機(jī)

1．在UVProbe界面上點(diǎn)擊[Disconnect]鍵，退出操作系統(tǒng)，并取出樣品池。

2．關(guān)閉UV-2550主機(jī)，關(guān)閉計(jì)算機(jī)、打印機(jī)、總電源。

3．在記錄本上記錄本次使用情況。

六、注意事項(xiàng)

樣品池內(nèi)溶液不要超過池容積的4/5，樣品池放入樣品室前外部用軟紙擦干。

第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日

注意事項(xiàng)1.光度計(jì)燈源壽命有限，若長時(shí)間不測(cè)量，應(yīng)通過UVProbe軟件斷開連接（點(diǎn)擊“Disconnect”），然后關(guān)閉光度計(jì)電源。2.使用分光光度計(jì)時(shí)要保證樣品室絕對(duì)干凈，小心放入樣品，放入比色皿前一定要先用濾紙和擦鏡紙將比色皿外表面擦干凈，不要污染樣品池和光度計(jì)外表面。3.儀器自檢和掃描的過程中，不要打開樣品室蓋。4.軟件不會(huì)自動(dòng)保存數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須點(diǎn)擊“Save”或者“SaveAs”進(jìn)行另存。否則數(shù)據(jù)會(huì)丟失。第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日光譜1.打開計(jì)算機(jī)和RF-5301PC熒光分光光度計(jì)開關(guān)。Windows啟動(dòng)后，雙擊RF-530XPC，自檢。2.從“AcquireMode”菜單中選擇[Spectrum]進(jìn)入Spectrum模式。

(1)從另外的數(shù)據(jù)獲取模式中進(jìn)入Spectrum，會(huì)自動(dòng)顯示光譜參數(shù)對(duì)話框。

(2)如果當(dāng)前模式已經(jīng)是Spectrum模式，從“Configure”菜單中選擇[Parameters],可顯示SpectrumParameters對(duì)話框。（如圖1）

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)使用方法第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日SpectrumParametersSpectrumType:○Excitation⊙Emission○SynchronousExWavelength:350nmEMWavelengthRange:Start370

End680RecordingRange:Low0.000High50.000ScanningSpeed:MediumSamplinglnterval(nm):0.2Slitwidth(nm):EX5EM5Sensitivity:⊙High○LowResponseTime[sec]:AutoRepeatScan…AutoFile…OKCancel

圖1第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊OK。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊<START>開始掃描。5.掃描結(jié)束后，會(huì)出現(xiàn)FileName對(duì)話框，這時(shí)輸入文件名。將光標(biāo)移至Comment文本框，輸入注釋。點(diǎn)擊<SAVE>，將數(shù)據(jù)保存。6.點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)菜單，選擇[Radar]，從副菜單中選擇[BothAxes]，自動(dòng)建立新的圖形限制。7.如果想擴(kuò)大光譜上某一特定區(qū)域，用鼠標(biāo)點(diǎn)此區(qū)域的左上角，并拖動(dòng)鼠標(biāo)至我們想要擴(kuò)大的區(qū)域范圍?；蛘邚暮衃Rader]的相同菜單中選擇[Limit]（點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵），設(shè)定新的圖形限制，在出現(xiàn)的對(duì)話框中輸入上限及下限。8.點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，讀取鼠標(biāo)所指位置的波長及熒光強(qiáng)度。之后選擇[CrossHair]→[Display]。9.移動(dòng)鼠標(biāo)所指區(qū)至想要的位置。10.選擇Display刪除鼠標(biāo)所指區(qū)域。11.在File菜單中選擇Save，儲(chǔ)存獲得的數(shù)據(jù)。第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日定量分析1.從“AcquireMode”菜單中選擇[Quantitative]，進(jìn)入Quantitative模式，會(huì)自動(dòng)顯示Quantitative參數(shù)對(duì)話框。2.按圖2所示確定獲得參數(shù)當(dāng)在method下方選擇“MultiPointWorkingCurve”時(shí)，會(huì)出現(xiàn)MultiPointCurve對(duì)話框。按圖3所示進(jìn)行選擇。第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日QuantitativePeramelersMethod:ConcentrationMultipointWorkingCurveUnits:ppbEXWavelength:350.0Range:0.000to100.00EMWavelength:450.0

RecordingRangeSlitWidth[nm]:EX5EM5Low0.000High1000.00Sensitivity:⊙High○LowResponseTime:Auto□AutoScanModeRepetitions:1

OKCancel圖2第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日MultipointWorkingCurveOrderofCurve…⊙Ist○2nd○3rdZerolnterception…○yes⊙NoOKCancel圖3第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊<OK>鍵。4.將裝有空白樣品的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊<AutoZero>設(shè)定零點(diǎn)。5.將第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣裝入池槽中并點(diǎn)擊<Read>，會(huì)出現(xiàn)StandardSampleDataEdit對(duì)話框。輸入標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值并點(diǎn)擊<OK>鍵。6.重復(fù)第五步繼續(xù)處理第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣。一旦獲得了足夠多的標(biāo)準(zhǔn)樣數(shù)據(jù)，在屏幕上便會(huì)自動(dòng)出現(xiàn)工作曲線。點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在出現(xiàn)的菜單中選擇[Rader]→[BothAxes]，便可自動(dòng)繪圖。7.在工作曲線繪制完成后，可定量確定未知樣的濃度。點(diǎn)擊<Unknown>鍵，出現(xiàn)UnknownAvquisition屏幕。8.將裝有未知樣品的池放入池槽中，點(diǎn)擊<Read>開始濃度的定量測(cè)定。9.在File菜單中選擇Save，儲(chǔ)存獲得的數(shù)據(jù)。10.在出現(xiàn)的對(duì)話框中輸入標(biāo)準(zhǔn)樣和未知樣的文件名，點(diǎn)擊<OK>鍵。第六十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日時(shí)間程序1.從“AcquireMode”菜單中選擇[TimeCourse]，進(jìn)入TimeCourse數(shù)據(jù)獲取模式，會(huì)自動(dòng)顯示TimeCourse參數(shù)對(duì)話框。2.按圖4所示確定獲得參數(shù)。3.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊<OK>鍵。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊<AutoZero>設(shè)定零點(diǎn)。以下步驟是基于時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)是在菡餾水的Raman峰的基礎(chǔ)上