力學方法治療骨關節(jié)炎的機理研究,理療學論文

力學方法治療骨關節(jié)炎的機理研究,理療學論文骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是中老年人的一種常見疾病,慢性起病,造成患者關節(jié)疼痛、畸形和功能障礙.已經有研究發(fā)現,通過一定大小和頻率的力學刺激來治療骨關節(jié)炎,具有明顯緩解異常感覺和狀態(tài)和改善關節(jié)功能的作用[1].但是力學治療采用多大的力度和頻率,至今尚無定論,而且治療OA的機制也尚未明確.關節(jié)軟骨的退變是OA發(fā)生和發(fā)展的重要機制.越來越多的研究表示清楚,軟骨細胞作為關節(jié)軟骨的主要組成部分,其凋亡與OA的進程關系密切[2].在OA患者的關節(jié)軟骨中,力學信號能夠通太多種途徑調控軟骨細胞的增殖和分化能力.本研究團隊的前期工作中已經證實,短期內持續(xù)的壓力能刺激軟骨細胞增殖,172kPa的持續(xù)壓力下,軟骨細胞的增殖能力最強[3-6].但是力學治療不僅講究加壓力度,施壓的頻率對治療效果也有影響.因而在持續(xù)性壓力的基礎上進一步研究不同頻率的周期性壓力,對揭示力學方式方法治療OA的機理研究具有重要意義.本研究將持續(xù)施加的壓力改良為施加不同頻率的周期性壓力,觀察不同頻率組的軟骨細胞增殖和整合素11分泌的差異,進一步揭示手法治療骨關節(jié)炎的機制.1材料與方式方法1.1主要試劑與儀器:胎牛血清(GIBCO,美國),培養(yǎng)液(Hy-clone,美國),Hanks液(Solarbio,中國),雙抗(GIBCO,美國),0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國),Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國),CO2培養(yǎng)箱(Thermo,型號:311,美國),超凈臺(再鑫儀器,VCM-620,中國),低溫高速臺式離心機(Eppendorf,美國),熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,型號:CKX43,日本),全自動酶標儀(Bio-Tek,型號:ELX900,美國).1.2施加不同頻率的周期性壓力控制裝置:通過前期研究使用的裝置[6],將壓力定為172kPa,加壓頻率根據分組要求設置B1組0.2Hz,B兩組0.5Hz,B3組1Hz,B4組2Hz和B5組5Hz.1.3兔關節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng)與傳代:①取出生時間不到12h的新生新西蘭兔2只,處死;②置于75%酒精100mL浸泡15min消毒;③放置在消毒容器里,于超凈臺中進行軟骨分離:剪刀剝離新生兔四肢長骨,剔除干凈肌肉、肌腱和筋膜等軟組織,用手術刀分離四肢骨骺端透明軟骨,并盡量切碎成小于1m3碎屑;④軟骨細胞消化分離:將切碎軟骨組織放入兩個無菌離心管,每管軟骨體積約為1mL,參加4mL(4倍于軟骨體積)0.25%胰蛋白酶,在37℃水浴鍋中消化約40min,參加4mL培養(yǎng)液(與胰蛋白酶等體積)終止消化,放入低溫高速臺式離心機配平后設定1500轉/min,離心5min,吸除上清液;參加4mL濃度為0.5mg/mLⅡ型膠原酶進一步消化,37℃水浴鍋中消化4h后,將液體通過200目篩網過濾,濾下的液體放入離心管再經低溫高速臺式離心機1500轉/min,離心5min,吸棄上清液,參加培養(yǎng)液重懸細胞,分別接種于4個培養(yǎng)皿,培養(yǎng)皿參加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,放入37℃、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第2天原代軟骨細胞貼壁即可換培養(yǎng)液,并于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況.可見原代軟骨細胞呈小圓、多角等形態(tài),胞漿淡、飽滿,見圖1.天天將培養(yǎng)皿在超凈臺中更換培養(yǎng)液一次,注意無菌操作,避免細胞污染.一般于24-48h后,顯微鏡下觀察軟骨細胞貼壁情況良好,細胞呈梭形.等長滿培養(yǎng)皿底部80-90%左右,即可進行消化傳代.傳代使用1:3的比例,傳至第三代細胞表型穩(wěn)定,即可進行實驗見圖2.1.4各組軟骨細胞增殖的測定:第三代兔軟骨細胞生長狀態(tài)良好、表型穩(wěn)定,用0.25%胰酶消化分離后離心機1500轉/min,離心5min,培養(yǎng)液重懸細胞,調整細胞懸液密度,按3105個/孔密度接種到6孔板,并分為:A組常規(guī)培養(yǎng)不施加壓力,B組172kPa壓力以不同頻率干涉2h/d:B1組頻率0.2Hz,B2組0.5Hz,B3組1Hz,B4組2Hz,B5組5Hz).干涉3d后各組按5104密度分別接種到96孔板,每組8孔,細胞過夜貼壁.第2天測定細胞增殖:吸棄96孔板培養(yǎng)上液,每孔參加100L含10%WST-1試劑的培養(yǎng)液,37℃孵育2h后,450nm波長測定各孔吸光度OD值.根據各孔的吸光度和對照孔的比值分析軟骨細胞的增殖情況.1.5各組軟骨細胞培養(yǎng)上清液中整合素11的測定:軟骨細胞培養(yǎng)及傳代同1.4,細胞消化分離后按3105個/孔密度接種到6孔板,分組與干涉方式方法同1.4.3d后收集各孔細胞上清液,放入離心管,離心機根據1500轉/min,離心20min,仔細收集上液,采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)測定各組培養(yǎng)上清液中整合素11的含量.1.6統(tǒng)計學分析:所有數據以x珋s表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對各組間差異進行單因素方差分析,P0.05為有統(tǒng)計學意義.2結果2.1不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細胞增殖的影響:一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干涉軟骨細胞2h/d,作用3d后,細胞OD值對照組A組為1.080.13,B1組為1.190.11,B2組為1.230.08,B3組為1.350.06,B4組為1.450.09,B5組為1.370.12.加壓各組與對照組比擬OD值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05).B組各組間OD值差異也有統(tǒng)計學意義(P0.05),峰值出如今B4組.見表1.2.2不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細胞分泌整合素11的影響:一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干涉軟骨細胞2h/d,作用3d后,整合素11水平對照組A組為3.020.26pg/mL,B1組為3.280.19pg/mL,B2組為3.430.11pg/mL,B3組為3.770.24pg/mL,B4組為4.010.09pg/mL,B5組為3.940.13pg/mL,周期性加壓各組與對照組比擬整合素11值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05).B組各組間差異也有統(tǒng)計學意義,峰值出如今B4組.見表1.一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力刺激兔軟骨細胞,均能增加軟骨細胞的增殖作用和整合素的含量.華而不實以2Hz的頻率作用最強.3討論OA是一種慢性、進展性骨關節(jié)疾病,發(fā)病率很高,給患者和社會帶來重大負擔.當前已得到共鳴的觀點是,關節(jié)軟骨的退變是導致OA發(fā)生發(fā)展的重要機制[7].關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質構成.膠原纖維是構成細胞外基質的主要構造,能構成復雜的網格狀構造,將軟骨細胞包裹在內,使關節(jié)軟骨能承受壓力、張力及剪切力.軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞類型[8],這些力學刺激通過膠原纖維傳導至軟骨細胞,引起細胞增殖、分化和凋亡等生理變化,最終調節(jié)軟骨的退變.整合素是軟骨細胞的一種膠原受體,由和兩個亞單位組成,能夠接受來自細胞外基質傳導到細胞的力學刺激信號.整合素在力學刺激下與相應的細胞外基質膠原蛋白結合后發(fā)生空間構造改變,介導了軟骨細胞與細胞外基質之間的信號通路,它是軟骨細胞力學信號轉導的前提,并進一步調控軟骨的增殖、分化、生長、凋亡甚至影響到細胞外基質的構造[9,10].有研究發(fā)現[11],整合素作為最重要的細胞外表力學刺激受體之一,通過細胞外基質-整合素-細胞骨架信號傳導通路,完成力學刺激的傳導,在防止細胞凋亡、調節(jié)細胞基因表示出,甚至在腫瘤的侵襲和轉移等生理和病理方面均起著重要的作用[12,13].已經知道軟骨細胞表示出的整合素有:整合素11、21、31、51、61、101、V3、V5等,正常成人軟骨細胞以1型整合素表示出為主[11],十分是11、31和51,因而11具有很高的研究價值.力學方式方法治療骨關節(jié)炎的作用機制離不開生物力學和軟骨細胞研究.軟骨細胞對骨關節(jié)炎的產生和發(fā)展起著關鍵作用.軟骨細胞的增殖分化與力學刺激有密切關系,整合素就是揭示這種關系的關鍵因子,因而研究力學方式方法對骨關節(jié)炎的作用機制,能夠從力學刺激-整合素-軟骨細胞-骨關節(jié)炎這條途徑著手.在前期研究中已經發(fā)現,適當的靜水壓力刺激軟骨細胞,能上調Ⅱ型膠原、蛋白多糖和糖氨聚糖等mRNA的表示出;并且在一定水平內靜水壓越高,軟骨細胞表型越穩(wěn)定[3,4].周期性力學刺激能促進基質合成,而持續(xù)性靜壓力則使基質合成減少[14].Kian[15]對體外培養(yǎng)的軟骨細胞施加24h周期性的牽張力,發(fā)現Ⅱ型膠原表示出上調,同時作為其受體的整合素1與之同步上調,而整合素5則只要較小的變化.馬軍利等[16]研究發(fā)現一定大小和適宜時間的靜壓力能促進整合素2的表示出,持續(xù)時間較長、較大的靜壓力則抑制軟骨整合素2的表示出.這些研究牽涉到力學刺激的大小和作用時間等參數,但是沒有深切進入研究力學刺激頻率對軟骨細胞代謝和基因表示出的影響.研究力學方式方法對骨關節(jié)炎治療的機制,必須同時說明力學大小和刺激頻率對軟骨細胞的影響機制,二者缺一不可.本研究在前期持續(xù)性壓力對軟骨細胞作用的實驗基礎上,采用同樣加壓力度、不同頻率的周期性壓力刺激軟骨細胞,研究不同的刺激頻率對軟骨細胞增殖以及整合素表示出的影響.結果顯示:施加172kPa,刺激頻率分別0.2Hz、0.5Hz、1Hz、2Hz、5Hz的周期性壓力,均能增加軟骨細胞的增殖作用和整合素11的含量.華而不實頻率為2Hz的周期性壓力作用最強.講明力學刺激能夠通過上調整合素11,引起基質成分的變化,進一步能夠上調軟骨細胞的增殖作用.但并非頻率越高作用越強.本實驗中以2Hz頻率的周期性壓力作用最強.這對揭示不同頻率的力學方式方法對骨關節(jié)炎治療效果的機制具有重要意義,并且在臨床治療骨關節(jié)炎時,對采取何種推拿手法,使用多大的力度和頻率進行力學方式方法治療具有指導意義.但是哪種頻率和多大的力度組合能得到最佳治療效果,還有這種組合的力學刺激在力學信號通路方面的研究尚未說明,這將成為今后研究的重點和趨勢.以下為參考文獻:[1]潘化平,馮慧,曹月龍.手法治療結合運動療法治療膝骨性關節(jié)炎進展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018,12:2934-2938.[2]張延輝,高春陽,李少華.骨性關節(jié)炎患者退變軟骨及滑膜組織中細胞因子的表示出[J].中國組織工程研究,2020,17(37):6671-6675.[3]黃正,黃好,傅文彧,等.不同類型靜水壓對兔軟骨細胞表型的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2007,15(2):29-33.[4]黃正,傅文彧,馮偉,等.循環(huán)靜水壓力對維持兔軟骨細胞表型的影響[J].中國骨傷,2007,20(3):180-183.[5]朱鴻飛,劉益杰,褚立希.力學刺激對軟骨細胞整合素亞單位的調控[J].中國骨傷,2018,24(3):266-268.[6]劉益杰,馮偉,楊松濱.不同循環(huán)靜壓力對兔軟骨細胞整合素11的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2020,46(7):13-15.[7]MallenCD,PeatG,PorcheretM.Osteoarthritis[J].BritishJournalofGeneralPractice,2008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