秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性比較,漁業(yè)論文

秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性比較,漁業(yè)論文細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)從屬于鮭形目鮭科鮭亞科。在我們國(guó)家主要分布在東北地區(qū)黑龍江流域、綏芬河、圖們江、鴨綠江,新疆的額爾齊斯河,河北省北部白河及灤河上游以及秦嶺北麓渭河流域。李思忠根據(jù)幽門(mén)盲囊、側(cè)線鱗和最小性成熟年齡等形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征,把分布在秦嶺地區(qū)的細(xì)鱗鮭定名為細(xì)鱗鮭的一個(gè)新亞種-秦嶺亞種(BrachymystaxlenoktsinlingensisLi),為我們國(guó)家特有種。由于其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,早在1938年就被人工引入到湑水河中進(jìn)行人工養(yǎng)殖。近年來(lái)環(huán)境污染加劇、不當(dāng)?shù)拈_(kāi)發(fā)和過(guò)度捕撈等原因的影響,秦嶺細(xì)鱗鮭資源量急劇減少,呈點(diǎn)狀分布在渭河上游部分支流中。1998年秦嶺細(xì)鱗鮭被收錄于(中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)-魚(yú)類〕中,屬瀕危物種,國(guó)家Ⅱ級(jí)保衛(wèi)水生野生動(dòng)物。當(dāng)前,針對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭的資源調(diào)查、生物學(xué)、胚胎發(fā)育和人工繁衍等方面的研究已有大量的報(bào)道,然而對(duì)其遺傳背景的研究較少,僅見(jiàn)原居林等采用RAPD技術(shù)對(duì)黑河種群和湑水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。為了逐步恢復(fù)和保衛(wèi)秦嶺細(xì)鱗鮭的種質(zhì)資源,對(duì)其自然種群數(shù)量進(jìn)行合理的補(bǔ)充,了解人工繁育群體和野生群體的遺傳背景是特別重要的。線粒體DNA(mtDNA)由于構(gòu)造簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快和幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn),使其成為研究物種起源、系統(tǒng)發(fā)生和種內(nèi)遺傳構(gòu)造的有效遺傳標(biāo)記,華而不實(shí)一些基因被廣泛應(yīng)用在魚(yú)類的種群遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育分析。王培欣等利用線粒體D-loop區(qū)分析得出8個(gè)流域叉尾斗魚(yú)種群遺傳多樣性很低且存在地理差異;高天翔等利用線粒體Cytb基因分析得出松江鱸8個(gè)群體的遺傳多樣性較高;張迪等利用線粒體COⅠ基因序列分析太湖新銀魚(yú)的遺傳多樣性,得出有人工移植歷史種群遺傳多樣性較高。本研究利用線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因序列對(duì)秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行比擬分析,以期為秦嶺細(xì)鱗鮭放流效果的跟蹤監(jiān)測(cè)、種質(zhì)資源遺傳保衛(wèi)提供重要根據(jù)。1材料與方式方法1.1樣品采集和DNA提取收集自渭河上游支流馬鹿河野生秦嶺細(xì)鱗鮭為野生群體,將收集自馬鹿河和渭河另一支流西河的秦嶺細(xì)鱗鮭人工馴化后,繁衍的子一代為繁育群體,各采集43個(gè)尾鰭樣品,用無(wú)水乙醇固定帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析,采用酚/氯仿法提取基因組DNA。1.2PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定擴(kuò)增mtDNA控制區(qū)序列的引物:正向引物為:LRBT-25:5-AGAGCGCCGGTGTTGTAATC-3反向引物為:LRBY-1195:5-GCTAGCGGGACTTTCTAGGGT-3。PCR反響體系為25L,華而不實(shí)包括1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa),1LdNTPs(2.5mmol/L),5L10?Taqbuffer(TaKaRa,含Mg2+),兩條引物(10mmol/L)各1L,3LDNA模板,其余雙蒸水補(bǔ)足。PCR反響程序?yàn)?94℃預(yù)變性3min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán);反響結(jié)束后在72℃再延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海美吉生物工程公司純化并測(cè)序,測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。擴(kuò)增線粒體Cytb基因序列的引物:L14724(5-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3);H15915(5-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3)。PCR反響體系為25L,華而不實(shí)包括1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa),1LdNTPs(2.5mmol/L),5L10Taqbuffer(TaKaRa,含Mg2+),兩條引物(10mmol/L)各1L,3LDNA模板,其余雙蒸水補(bǔ)足。PCR反響程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,50℃退火45s,72℃延伸45s,共35個(gè)循環(huán);反響結(jié)束后在72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海美吉生物工程公司純化并測(cè)序,測(cè)序引物為擴(kuò)增引物。1.3數(shù)據(jù)分析測(cè)序獲得的序列通過(guò)Chromas1.45軟件獲得原始序列數(shù)據(jù);利用CLUSTALX2軟件對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì),參照測(cè)序圖進(jìn)行人工校正。利用PAUP*V4.0軟件進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)(Paritionhomoge-neitytest)序列片段聯(lián)合分析的可靠性;用DnaSP5.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等;運(yùn)用Arlequin3.1軟件中的分子變異(AMOVA)方式方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及遺傳分化指數(shù)Fst值及其P值(用排列測(cè)驗(yàn)法,1000次重排后的顯著性檢驗(yàn)),根據(jù)Nm=(1Fst)/2Fst得到種群間的基因流值;用Mega4.0軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成,并基于Kimura2-papamter模型計(jì)算單倍型及群體間的遺傳距離,用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì),循環(huán)次數(shù)為1000次。Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,用以檢測(cè)單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。2結(jié)果2.1序列分析對(duì)野生群體和繁育群體的線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)排序后,得到730bp的同源序列。43尾繁育群體所得序列共包含20個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)15個(gè),單突變位點(diǎn)5個(gè)。所有序列間沒(méi)有出現(xiàn)缺失與插入,4個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn),1個(gè)顛換位點(diǎn),平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為4.3。在野生群體中,43個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到26個(gè)變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)21個(gè),單突變位點(diǎn)5個(gè),平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.3。在秦嶺細(xì)鱗鮭養(yǎng)殖群體與野生群體中,86個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到27個(gè)變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)26個(gè),單突變位點(diǎn)1個(gè),平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.4。堿基組成分析顯示,A、T、C和G堿基平均含量分別為31.9%、31.6%、20.8%和15.7%,華而不實(shí)A+T含量(63.5%)明顯高于G+C含量(36.5%),表現(xiàn)出明顯的AT偏好和反G偏倚,與其他脊椎動(dòng)物線粒體控制區(qū)核苷酸的組成特點(diǎn)相一致。獲得86尾個(gè)體線粒體Cytb基因全序列共1141bp。所得的序列共包含25個(gè)變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)24個(gè),單突變位點(diǎn)1個(gè)。A、T、C和G堿基平均含量分別為24.6%、28.2%、31.6%和15.6%,華而不實(shí)A+T含量(52.8%)明顯高于G+C含量(47.2%)。43尾野生群體所含序列共有23個(gè)變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)16個(gè),單突變位點(diǎn)7個(gè)。43尾繁育群體所含序列共有10個(gè)變異位點(diǎn),華而不實(shí)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)9個(gè),單突變位點(diǎn)1個(gè)。2.2遺傳多樣性對(duì)86尾個(gè)體的控制區(qū)片段和Cytb基因片段進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn),結(jié)果顯示兩者之間是一致的(P=0.13)?；?871bp線粒體基因聯(lián)合片段分析秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體的遺傳多樣性信息見(jiàn)表1,由表1中能夠看出86尾個(gè)體共檢測(cè)出34個(gè)單倍型,顯示出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性(h=0.9190.022;=0.003210.00077)。繁育群體與野生群體相比擬,繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(h=0.9170.035;=0.003490.00083)都高于野生群體(h=0.9070.026;=0.002870.00074)。在秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體43尾個(gè)體檢測(cè)出24個(gè)單倍型,野生群體43尾個(gè)體檢測(cè)出18個(gè)單倍型,華而不實(shí)兩群體分享8個(gè)單倍型,占總單倍型個(gè)數(shù)的23.5%?！颈?】2.3群體遺傳分化通過(guò)計(jì)算兩群體間的遺傳距離得出,繁育群體和野生群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.004和0.003,繁育群體和野生群體之間的遺傳距離為0.003,略低于繁育群體內(nèi)的遺傳距離,與野生群體的遺傳距離相近。分子變異(AMOVA)結(jié)果顯示(表2),秦嶺細(xì)鱗鮭群體內(nèi)的存在較高的遺傳變異,占98.37%,而群體間的變異僅占1.63%,表示清楚分子之間遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)的個(gè)體之間。兩群體之間的Fst=0.01631(P=0.1075),Nm=30.16,也顯示出秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化不顯著?！颈?】2.4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體24個(gè)單倍型和野生群體18個(gè)單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)能夠看出,各野生群體和繁育群體的個(gè)體均為構(gòu)成單系群,兩者之間互有穿插,表示清楚兩群體的遺傳類似性較高,親緣關(guān)系較近。由network軟件構(gòu)成秦嶺細(xì)鱗鮭群體34個(gè)單倍型的簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)也顯示出發(fā)散狀態(tài)勢(shì),兩群體未構(gòu)成各自的單系群。單倍型H3位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心,且享有該單倍型的個(gè)體數(shù)量在種群中所占的比例明顯高于其他單倍型所占比例,表示清楚H3可能是原始單倍型?！緢D1-2】3討論3.1群體的遺傳多樣性物種遺傳多樣性的高低是評(píng)判物種能否長(zhǎng)期存在的根據(jù),核苷酸多樣性是衡量一個(gè)種群mtDNA的遺傳多樣性的重要指標(biāo),表示各種線粒體DNA單倍型在群體中所占的比例。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,秦嶺細(xì)鱗鮭86尾個(gè)體的單倍型多樣性(h=0.9190.022)較高,但核苷酸多樣性(=0.003210.00077)較低,在銀鯧、鲇魚(yú)和松江鱸等魚(yú)類中也存在這種現(xiàn)象,這種單倍型多樣性較高核苷酸多樣性較低的現(xiàn)象表示清楚秦嶺細(xì)鱗鮭群體可能是由一個(gè)較小種群經(jīng)歷奠基者效應(yīng)或瓶頸效應(yīng)后迅速擴(kuò)張,隨著個(gè)體數(shù)量的增加,導(dǎo)致單倍型多樣性提高,但缺少足夠的時(shí)間來(lái)積累核苷酸序列的變異,這種揣測(cè)與秦嶺細(xì)鱗鮭的起源歷程相一致。但本文中得到的秦嶺細(xì)鱗鮭單倍型多樣性較高的結(jié)論與夏穎哲等分析黃河地區(qū)細(xì)鱗鮭的單倍型多樣性(0.622)的結(jié)果不符,這可能由于夏穎哲等采集樣本數(shù)量(n=10)較少影響了遺傳多樣性的正確評(píng)估。在本研究中繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸遺傳多樣性(h=0.9170.035;=0.003490.00083)都高于野生群體(h=0.9070.026;=0.002870.00074),與原居林等對(duì)黑河種群和湑水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析得出秦嶺細(xì)鱗鮭繁衍群體后代遺傳多樣性降低的結(jié)論不相符,這可能是由于本實(shí)驗(yàn)繁衍群體親本來(lái)源分布較廣,且每年都會(huì)補(bǔ)充一定數(shù)量的親本,有效避免了近親繁衍和瓶頸效應(yīng),保持了秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體的遺傳多樣性。而原居林等所采集樣本為20世紀(jì)30年代引入到湑水河中進(jìn)行馴養(yǎng)的群體,在長(zhǎng)期的人工繁衍經(jīng)過(guò)中,由于基礎(chǔ)繁育群體數(shù)量較少、近親繁衍和遺傳漂變等因素,使得養(yǎng)殖群體喪失一些多態(tài)等位基因造成遺傳多樣性水平降低。3.2群體的遺傳構(gòu)造分析群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)是評(píng)價(jià)一個(gè)群體多態(tài)程度的重要指標(biāo)。種群間遺傳距離D值的范圍是00.05,亞種間的遺傳距離D值范圍是0.020.2。本研究結(jié)果表示清楚,秦嶺細(xì)鱗鮭2個(gè)種群內(nèi)的遺傳距離為(0.0030.004),繁育群體與野生群體之間的遺傳距離為0.003,表示清楚秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體與野生群體之間的遺傳變異程度低,分化程度不明顯。秦嶺細(xì)鱗鮭群體單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖分析結(jié)果表示清楚,繁育群體和野生群體之間無(wú)明顯的遺傳分化,兩者的遺傳類似程度較高。根據(jù)Wright關(guān)于遺傳分化程度的理論以為Fst值在00.05表示低度遺傳分化,秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和野生群體之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.01631,表示清楚兩群體之間存在低度遺傳分化,分子變異(AMOVA)的分析結(jié)果顯示,98.37%的遺傳變異來(lái)源與群體內(nèi),僅有1.63%的變異來(lái)源與兩群體之間。由基因流Nm值來(lái)看,基因流是指基因從一個(gè)群體遷移至另一個(gè)群體時(shí)產(chǎn)生的基因流動(dòng),一般以為Nm1,表示清楚群體間的基因流水平較高,遺傳分化較小。秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體之間的基因流Nm值到達(dá)30.16,遠(yuǎn)大于1,也同樣表示清楚了兩群體之間的遺傳分化較小,這可能是由于兩者之間分享單倍型較多有關(guān)。秦嶺細(xì)鱗鮭資源量的減少能夠通過(guò)人工增殖手段來(lái)恢復(fù),但假如其種群遺傳多樣性的降低卻難以彌補(bǔ)。當(dāng)前秦嶺細(xì)鱗鮭的繁育群體主要用于增殖放流,保持其較高的種群遺傳多樣性具有重要意義。以下為參考文獻(xiàn)：[1]QinSZ,WangSA.StudiesonthesubspeciesofBrachymystaxlenok[J].SalmonFishery,1989,2(1):5261[秦樹(shù)臻,王所安.細(xì)鱗魚(yú)亞種問(wèn)題的研究.鮭鱒漁業(yè),1989,2(1):5261][2]LiSZ.DiscussedthegeographicaldistributionofChinasalmonidaefish[J].Chinese