秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性比較,漁業(yè)論文

秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性比較,漁業(yè)論文細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)從屬于鮭形目鮭科鮭亞科。在我們國家主要分布在東北地區(qū)黑龍江流域、綏芬河、圖們江、鴨綠江,新疆的額爾齊斯河,河北省北部白河及灤河上游以及秦嶺北麓渭河流域。李思忠根據(jù)幽門盲囊、側(cè)線鱗和最小性成熟年齡等形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征,把分布在秦嶺地區(qū)的細(xì)鱗鮭定名為細(xì)鱗鮭的一個新亞種-秦嶺亞種(BrachymystaxlenoktsinlingensisLi),為我們國家特有種。由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高,早在1938年就被人工引入到湑水河中進(jìn)行人工養(yǎng)殖。近年來環(huán)境污染加劇、不當(dāng)?shù)拈_發(fā)和過度捕撈等原因的影響,秦嶺細(xì)鱗鮭資源量急劇減少,呈點狀分布在渭河上游部分支流中。1998年秦嶺細(xì)鱗鮭被收錄于(中國瀕危動物紅皮書-魚類〕中,屬瀕危物種,國家Ⅱ級保衛(wèi)水生野生動物。當(dāng)前,針對秦嶺細(xì)鱗鮭的資源調(diào)查、生物學(xué)、胚胎發(fā)育和人工繁衍等方面的研究已有大量的報道,然而對其遺傳背景的研究較少,僅見原居林等采用RAPD技術(shù)對黑河種群和湑水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。為了逐步恢復(fù)和保衛(wèi)秦嶺細(xì)鱗鮭的種質(zhì)資源,對其自然種群數(shù)量進(jìn)行合理的補充,了解人工繁育群體和野生群體的遺傳背景是特別重要的。線粒體DNA(mtDNA)由于構(gòu)造簡單、進(jìn)化速度快和幾乎不發(fā)生重組等特點,使其成為研究物種起源、系統(tǒng)發(fā)生和種內(nèi)遺傳構(gòu)造的有效遺傳標(biāo)記,華而不實一些基因被廣泛應(yīng)用在魚類的種群遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育分析。王培欣等利用線粒體D-loop區(qū)分析得出8個流域叉尾斗魚種群遺傳多樣性很低且存在地理差異;高天翔等利用線粒體Cytb基因分析得出松江鱸8個群體的遺傳多樣性較高;張迪等利用線粒體COⅠ基因序列分析太湖新銀魚的遺傳多樣性,得出有人工移植歷史種群遺傳多樣性較高。本研究利用線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因序列對秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體和野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行比擬分析,以期為秦嶺細(xì)鱗鮭放流效果的跟蹤監(jiān)測、種質(zhì)資源遺傳保衛(wèi)提供重要根據(jù)。1材料與方式方法1.1樣品采集和DNA提取收集自渭河上游支流馬鹿河野生秦嶺細(xì)鱗鮭為野生群體,將收集自馬鹿河和渭河另一支流西河的秦嶺細(xì)鱗鮭人工馴化后,繁衍的子一代為繁育群體,各采集43個尾鰭樣品,用無水乙醇固定帶回實驗室進(jìn)行分析,采用酚/氯仿法提取基因組DNA。1.2PCR擴增和序列測定擴增mtDNA控制區(qū)序列的引物:正向引物為:LRBT-25:5-AGAGCGCCGGTGTTGTAATC-3反向引物為:LRBY-1195:5-GCTAGCGGGACTTTCTAGGGT-3。PCR反響體系為25L,華而不實包括1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa),1LdNTPs(2.5mmol/L),5L10?Taqbuffer(TaKaRa,含Mg2+),兩條引物(10mmol/L)各1L,3LDNA模板,其余雙蒸水補足。PCR反響程序為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸45s,共30個循環(huán);反響結(jié)束后在72℃再延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物工程公司純化并測序,測序引物為擴增引物。擴增線粒體Cytb基因序列的引物:L14724(5-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3);H15915(5-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3)。PCR反響體系為25L,華而不實包括1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa),1LdNTPs(2.5mmol/L),5L10Taqbuffer(TaKaRa,含Mg2+),兩條引物(10mmol/L)各1L,3LDNA模板,其余雙蒸水補足。PCR反響程序為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,50℃退火45s,72℃延伸45s,共35個循環(huán);反響結(jié)束后在72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物工程公司純化并測序,測序引物為擴增引物。1.3數(shù)據(jù)分析測序獲得的序列通過Chromas1.45軟件獲得原始序列數(shù)據(jù);利用CLUSTALX2軟件對所有序列進(jìn)行比對,參照測序圖進(jìn)行人工校正。利用PAUP*V4.0軟件進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(Paritionhomoge-neitytest)序列片段聯(lián)合分析的可靠性;用DnaSP5.0軟件計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等;運用Arlequin3.1軟件中的分子變異(AMOVA)方式方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及遺傳分化指數(shù)Fst值及其P值(用排列測驗法,1000次重排后的顯著性檢驗),根據(jù)Nm=(1Fst)/2Fst得到種群間的基因流值;用Mega4.0軟件統(tǒng)計堿基組成,并基于Kimura2-papamter模型計算單倍型及群體間的遺傳距離,用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計,循環(huán)次數(shù)為1000次。Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,用以檢測單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。2結(jié)果2.1序列分析對野生群體和繁育群體的線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行比對排序后,得到730bp的同源序列。43尾繁育群體所得序列共包含20個核苷酸變異位點,華而不實簡約信息位點15個,單突變位點5個。所有序列間沒有出現(xiàn)缺失與插入,4個轉(zhuǎn)換位點,1個顛換位點,平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為4.3。在野生群體中,43個個體共檢測到26個變異位點,華而不實簡約信息位點21個,單突變位點5個,平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.3。在秦嶺細(xì)鱗鮭養(yǎng)殖群體與野生群體中,86個個體共檢測到27個變異位點,華而不實簡約信息位點26個,單突變位點1個,平均轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)比值為3.4。堿基組成分析顯示,A、T、C和G堿基平均含量分別為31.9%、31.6%、20.8%和15.7%,華而不實A+T含量(63.5%)明顯高于G+C含量(36.5%),表現(xiàn)出明顯的AT偏好和反G偏倚,與其他脊椎動物線粒體控制區(qū)核苷酸的組成特點相一致。獲得86尾個體線粒體Cytb基因全序列共1141bp。所得的序列共包含25個變異位點,華而不實簡約信息位點24個,單突變位點1個。A、T、C和G堿基平均含量分別為24.6%、28.2%、31.6%和15.6%,華而不實A+T含量(52.8%)明顯高于G+C含量(47.2%)。43尾野生群體所含序列共有23個變異位點,華而不實簡約信息位點16個,單突變位點7個。43尾繁育群體所含序列共有10個變異位點,華而不實簡約信息位點9個,單突變位點1個。2.2遺傳多樣性對86尾個體的控制區(qū)片段和Cytb基因片段進(jìn)行同質(zhì)性檢驗,結(jié)果顯示兩者之間是一致的(P=0.13)。基于1871bp線粒體基因聯(lián)合片段分析秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體的遺傳多樣性信息見表1,由表1中能夠看出86尾個體共檢測出34個單倍型,顯示出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性(h=0.9190.022;=0.003210.00077)。繁育群體與野生群體相比擬,繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(h=0.9170.035;=0.003490.00083)都高于野生群體(h=0.9070.026;=0.002870.00074)。在秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體43尾個體檢測出24個單倍型,野生群體43尾個體檢測出18個單倍型,華而不實兩群體分享8個單倍型,占總單倍型個數(shù)的23.5%。【表1】2.3群體遺傳分化通過計算兩群體間的遺傳距離得出,繁育群體和野生群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.004和0.003,繁育群體和野生群體之間的遺傳距離為0.003,略低于繁育群體內(nèi)的遺傳距離,與野生群體的遺傳距離相近。分子變異(AMOVA)結(jié)果顯示(表2),秦嶺細(xì)鱗鮭群體內(nèi)的存在較高的遺傳變異,占98.37%,而群體間的變異僅占1.63%,表示清楚分子之間遺傳變異主要來自于群體內(nèi)的個體之間。兩群體之間的Fst=0.01631(P=0.1075),Nm=30.16,也顯示出秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化不顯著?！颈?】2.4系統(tǒng)發(fā)育樹由秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體24個單倍型和野生群體18個單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)能夠看出,各野生群體和繁育群體的個體均為構(gòu)成單系群,兩者之間互有穿插,表示清楚兩群體的遺傳類似性較高,親緣關(guān)系較近。由network軟件構(gòu)成秦嶺細(xì)鱗鮭群體34個單倍型的簡約網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)也顯示出發(fā)散狀態(tài)勢,兩群體未構(gòu)成各自的單系群。單倍型H3位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心,且享有該單倍型的個體數(shù)量在種群中所占的比例明顯高于其他單倍型所占比例,表示清楚H3可能是原始單倍型。【圖1-2】3討論3.1群體的遺傳多樣性物種遺傳多樣性的高低是評判物種能否長期存在的根據(jù),核苷酸多樣性是衡量一個種群mtDNA的遺傳多樣性的重要指標(biāo),表示各種線粒體DNA單倍型在群體中所占的比例。由實驗結(jié)果可知,秦嶺細(xì)鱗鮭86尾個體的單倍型多樣性(h=0.9190.022)較高,但核苷酸多樣性(=0.003210.00077)較低,在銀鯧、鲇魚和松江鱸等魚類中也存在這種現(xiàn)象,這種單倍型多樣性較高核苷酸多樣性較低的現(xiàn)象表示清楚秦嶺細(xì)鱗鮭群體可能是由一個較小種群經(jīng)歷奠基者效應(yīng)或瓶頸效應(yīng)后迅速擴張,隨著個體數(shù)量的增加,導(dǎo)致單倍型多樣性提高,但缺少足夠的時間來積累核苷酸序列的變異,這種揣測與秦嶺細(xì)鱗鮭的起源歷程相一致。但本文中得到的秦嶺細(xì)鱗鮭單倍型多樣性較高的結(jié)論與夏穎哲等分析黃河地區(qū)細(xì)鱗鮭的單倍型多樣性(0.622)的結(jié)果不符,這可能由于夏穎哲等采集樣本數(shù)量(n=10)較少影響了遺傳多樣性的正確評估。在本研究中繁育群體的單倍型多樣性和核苷酸遺傳多樣性(h=0.9170.035;=0.003490.00083)都高于野生群體(h=0.9070.026;=0.002870.00074),與原居林等對黑河種群和湑水河種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析得出秦嶺細(xì)鱗鮭繁衍群體后代遺傳多樣性降低的結(jié)論不相符,這可能是由于本實驗繁衍群體親本來源分布較廣,且每年都會補充一定數(shù)量的親本,有效避免了近親繁衍和瓶頸效應(yīng),保持了秦嶺細(xì)鱗鮭人工繁育群體的遺傳多樣性。而原居林等所采集樣本為20世紀(jì)30年代引入到湑水河中進(jìn)行馴養(yǎng)的群體,在長期的人工繁衍經(jīng)過中,由于基礎(chǔ)繁育群體數(shù)量較少、近親繁衍和遺傳漂變等因素,使得養(yǎng)殖群體喪失一些多態(tài)等位基因造成遺傳多樣性水平降低。3.2群體的遺傳構(gòu)造分析群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)是評價一個群體多態(tài)程度的重要指標(biāo)。種群間遺傳距離D值的范圍是00.05,亞種間的遺傳距離D值范圍是0.020.2。本研究結(jié)果表示清楚,秦嶺細(xì)鱗鮭2個種群內(nèi)的遺傳距離為(0.0030.004),繁育群體與野生群體之間的遺傳距離為0.003,表示清楚秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體與野生群體之間的遺傳變異程度低,分化程度不明顯。秦嶺細(xì)鱗鮭群體單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹和網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖分析結(jié)果表示清楚,繁育群體和野生群體之間無明顯的遺傳分化,兩者的遺傳類似程度較高。根據(jù)Wright關(guān)于遺傳分化程度的理論以為Fst值在00.05表示低度遺傳分化,秦嶺細(xì)鱗鮭繁育群體和野生群體之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.01631,表示清楚兩群體之間存在低度遺傳分化,分子變異(AMOVA)的分析結(jié)果顯示,98.37%的遺傳變異來源與群體內(nèi),僅有1.63%的變異來源與兩群體之間。由基因流Nm值來看,基因流是指基因從一個群體遷移至另一個群體時產(chǎn)生的基因流動,一般以為Nm1,表示清楚群體間的基因流水平較高,遺傳分化較小。秦嶺細(xì)鱗鮭野生群體與繁育群體之間的基因流Nm值到達(dá)30.16,遠(yuǎn)大于1,也同樣表示清楚了兩群體之間的遺傳分化較小,這可能是由于兩者之間分享單倍型較多有關(guān)。秦嶺細(xì)鱗鮭資源量的減少能夠通過人工增殖手段來恢復(fù),但假如其種群遺傳多樣性的降低卻難以彌補。當(dāng)前秦嶺細(xì)鱗鮭的繁育群體主要用于增殖放流,保持其較高的種群遺傳多樣性具有重要意義。以下為參考文獻(xiàn)：[1]QinSZ,WangSA.StudiesonthesubspeciesofBrachymystaxlenok[J].SalmonFishery,1989,2(1):5261[秦樹臻,王所安.細(xì)鱗魚亞種問題的研究.鮭鱒漁業(yè),1989,2(1):5261][2]LiSZ.DiscussedthegeographicaldistributionofChinasalmonidaefish[J].Chinese