分子發(fā)光光譜法(福大儀器分析)

第4章分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光的類型-按激發(fā)的模式分類：光致發(fā)光：分子吸收光能被激發(fā)，所產(chǎn)生的發(fā)光：分子熒光和磷光化學(xué)發(fā)光：分子由化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能所激發(fā)生物發(fā)光：分子由生物體體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)釋放出來的能量所激發(fā)分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)

靈敏度高。較吸收光度法一般要高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。選擇性比較高。樣品量小，操作簡便，工作曲線的動(dòng)態(tài)線性范圍寬。4.1熒光與磷光的基本原理第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生

分子能級(jí)：電子能級(jí)、振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1

、S2…；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1

、T2…；4.1熒光與磷光的基本原理第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率??；

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生-分子的去激發(fā)過程非輻射能量傳遞過程

（1）振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。

（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生-分子的去激發(fā)過程非輻射能量傳遞過程

（3）外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。（4）系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷（S1T1)。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生-分子的去激發(fā)過程輻射能量傳遞過程

(1)熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為‘2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；‘2>2>1第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生-分子的去激發(fā)過程輻射能量傳遞過程

(2)磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-3～10s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.2熒光量子效率熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.3熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測(cè)量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征

1.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征2.

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征3.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如‘2)。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-分子結(jié)構(gòu)第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-分子結(jié)構(gòu)（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-分子結(jié)構(gòu)（4）取代基效應(yīng)：第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-分子結(jié)構(gòu)（4）取代基效應(yīng)：P316/表14.1第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響（2）溫度的影響（熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感）第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響（2）溫度的影響（3）溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；（4）猝滅

發(fā)光分子與溶劑或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過程。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-環(huán)境因素（4）猝滅

發(fā)光分子與溶劑或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過程。與發(fā)光分子相互作用而引起發(fā)光強(qiáng)度下降的物質(zhì)，稱為猝滅劑（如氧,一般需除氧）。動(dòng)態(tài)猝滅：猝滅劑與發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用靜態(tài)猝滅：猝滅劑與發(fā)光物質(zhì)的基態(tài)分子之間的相互作用第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素-環(huán)境因素（5）內(nèi)濾作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜

的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光,如色胺酸中的重鉻酸鉀；第4章分子發(fā)光光譜法4.2分子熒光光譜儀激發(fā)光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))樣品池：石英池雙單色器系統(tǒng)：激發(fā)單色器（選擇激發(fā)光波長）；

發(fā)射單色器（選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長）檢測(cè)器：光電倍增管。

第4章分子發(fā)光光譜法4.3分子熒光光譜法的應(yīng)用（1）靈敏度高

比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)檢測(cè)下限：0.1～0.001g/cm3（2）選擇性強(qiáng)

既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1熒光定量分析熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-bc)If=I0(1-10-bc)=I0(1-e-2.303bc)

濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If=2.303I0bc

=Kc4.3.1.1熒光強(qiáng)度與濃度的基本關(guān)系式第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測(cè)定和間接測(cè)定1.直接測(cè)定法

要求被分析物本身具有熒光。通常采用相對(duì)測(cè)量方法，如工作曲線法。每次測(cè)繪工作曲線最好用同一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)校準(zhǔn)儀器的讀數(shù)。2.間接測(cè)定法被分析物本身不發(fā)熒光，或者因熒光量子產(chǎn)率太低而無法進(jìn)行直接測(cè)定，便只能采用間接測(cè)定的辦法。如：光衍生法、熒光猝滅法、敏化熒光法等第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測(cè)定和間接測(cè)定(1)無機(jī)化合物與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析（見表）第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測(cè)定和間接測(cè)定第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測(cè)定和間接測(cè)定第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.3多組分的熒光測(cè)定第4章分子發(fā)光光譜法4.4磷光光譜法

磷光發(fā)射：T1→S0躍遷；

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換

→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-3～10s

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間

熒光發(fā)射：

S1→S0躍遷；

10-7～10-9s

第4章分子發(fā)光光譜法4.4.1低溫磷光

由于三重態(tài)壽命較長，為減小非輻射失活過程的影響，通常應(yīng)在低溫條件下測(cè)量磷光。

液氮是最常用的冷卻劑，因而要求所使用的溶劑在液氮溫度下應(yīng)具有足夠的黏度并能形成明凈的剛性玻璃體，且對(duì)分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光譜區(qū)內(nèi)沒有很強(qiáng)的吸收和發(fā)射，并容易制備和提純。

第4章分子發(fā)光光譜法4.4.2室溫磷光

固態(tài)基質(zhì)表面室溫磷光分析：分析物通過物理吸附或某種化學(xué)作用力被束縛在固體基質(zhì)表面，增大了剛性，減小了碰撞失活的概率，在嚴(yán)格干燥試樣的情況下限制了氧的猝滅作用，顯示室溫磷光。

膠束穩(wěn)定的室溫磷光分析：磷光體進(jìn)入表面活性劑的膠束溶液中，微環(huán)境和定向約束力發(fā)生變化，減小內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射失活過程概率，明顯增大三重態(tài)的穩(wěn)定性，使磷光強(qiáng)度顯著增大。

敏化室溫磷光分析第4章分子發(fā)光光譜法4.4.3磷光分析儀

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。

測(cè)量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。第4章分子發(fā)光光譜法4.4.4磷光分析的應(yīng)用第4章分子發(fā)光光譜法4.4.4磷光分析的應(yīng)用第4章分子發(fā)光光譜法4.5化學(xué)發(fā)光分析

化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)提供的能量激發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射。生物發(fā)光是指產(chǎn)生于生物體系中的化學(xué)發(fā)光?；谶@類發(fā)光現(xiàn)象的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光（或生物發(fā)光）分析法。

優(yōu)點(diǎn)：(1).靈敏度很高。(2).儀器設(shè)備簡單，無須光源和單色器，因而也消除了散射光和雜散光的干擾；(3).線性范圍寬；(4).分析速度快。

局限：目前可供應(yīng)用的發(fā)光體系尚有限，發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究，方法的選擇性有待進(jìn)一步提高。

第4章分子發(fā)光光譜法

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。4.5.1化學(xué)發(fā)光分析原理第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1.直接化學(xué)發(fā)光A+B=C*+DC*

→C+h第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型2.間接化學(xué)發(fā)光第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型3.液相化學(xué)發(fā)光

發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；光澤精等

該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子（如Fe2+,Cu2+

等）可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測(cè)定這些金屬離子。魯米諾在堿性溶液