分子發(fā)光光譜法(福大儀器分析)

第4章分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光的類型-按激發(fā)的模式分類：光致發(fā)光：分子吸收光能被激發(fā)，所產生的發(fā)光：分子熒光和磷光化學發(fā)光：分子由化學反應的化學能所激發(fā)生物發(fā)光：分子由生物體體內的化學反應釋放出來的能量所激發(fā)分子發(fā)光分析法的特點

靈敏度高。較吸收光度法一般要高2~3個數(shù)量級。選擇性比較高。樣品量小，操作簡便，工作曲線的動態(tài)線性范圍寬。4.1熒光與磷光的基本原理第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生

分子能級：電子能級、振動、轉動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1

、S2…；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1

、T2…；4.1熒光與磷光的基本原理第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率?。?/p>

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生-分子的去激發(fā)過程非輻射能量傳遞過程

（1）振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。

（2）內轉換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生-分子的去激發(fā)過程非輻射能量傳遞過程

（3）外轉換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷；外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。（4）系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷（S1T1)。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生-分子的去激發(fā)過程輻射能量傳遞過程

(1)熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為‘2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；‘2>2>1第4章分子發(fā)光光譜法4.1.1分子熒光與磷光的產生-分子的去激發(fā)過程輻射能量傳遞過程

(2)磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內轉換→系間跨越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-3～10s。

光照停止后，可持續(xù)一段時間。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.2熒光量子效率熒光物質吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.3熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線（圖中曲線I）。2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征

1.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征2.

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.4熒光光譜的特征3.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產生波長一定的熒光(如‘2)。

第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-分子結構第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-分子結構（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產生；（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移。（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-分子結構（4）取代基效應：第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-分子結構（4）取代基效應：P316/表14.1第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響

除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響（2）溫度的影響（熒光強度對溫度變化敏感）第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-環(huán)境因素（1）溶劑的影響（2）溫度的影響（3）溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；（4）猝滅

發(fā)光分子與溶劑或溶質分子之間所發(fā)生的導致發(fā)光強度下降的物理或化學作用過程。第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-環(huán)境因素（4）猝滅

發(fā)光分子與溶劑或溶質分子之間所發(fā)生的導致發(fā)光強度下降的物理或化學作用過程。與發(fā)光分子相互作用而引起發(fā)光強度下降的物質，稱為猝滅劑（如氧,一般需除氧）。動態(tài)猝滅：猝滅劑與發(fā)光物質的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用靜態(tài)猝滅：猝滅劑與發(fā)光物質的基態(tài)分子之間的相互作用第4章分子發(fā)光光譜法4.1.5影響熒光強度的因素-環(huán)境因素（5）內濾作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜

的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。內濾作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射的熒光,如色胺酸中的重鉻酸鉀；第4章分子發(fā)光光譜法4.2分子熒光光譜儀激發(fā)光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))樣品池：石英池雙單色器系統(tǒng)：激發(fā)單色器（選擇激發(fā)光波長）；

發(fā)射單色器（選擇發(fā)射光(測量)波長）檢測器：光電倍增管。

第4章分子發(fā)光光譜法4.3分子熒光光譜法的應用（1）靈敏度高

比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級檢測下限：0.1～0.001g/cm3（2）選擇性強

既可依據特征發(fā)射光譜，又可根據特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點：應用范圍小。第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1熒光定量分析熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-bc)If=I0(1-10-bc)=I0(1-e-2.303bc)

濃度很低時，將括號項近似處理后：

If=2.303I0bc

=Kc4.3.1.1熒光強度與濃度的基本關系式第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測定和間接測定1.直接測定法

要求被分析物本身具有熒光。通常采用相對測量方法，如工作曲線法。每次測繪工作曲線最好用同一種穩(wěn)定的熒光物質校準儀器的讀數(shù)。2.間接測定法被分析物本身不發(fā)熒光，或者因熒光量子產率太低而無法進行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。如：光衍生法、熒光猝滅法、敏化熒光法等第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測定和間接測定(1)無機化合物與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機化合物的分析（見表）第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測定和間接測定第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.2單組分的熒光直接測定和間接測定第4章分子發(fā)光光譜法4.3.1.3多組分的熒光測定第4章分子發(fā)光光譜法4.4磷光光譜法

磷光發(fā)射：T1→S0躍遷；

S0→激發(fā)→振動弛豫→內轉換

→系間跨越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-3～10s

光照停止后，可持續(xù)一段時間

熒光發(fā)射：

S1→S0躍遷；

10-7～10-9s

第4章分子發(fā)光光譜法4.4.1低溫磷光

由于三重態(tài)壽命較長，為減小非輻射失活過程的影響，通常應在低溫條件下測量磷光。

液氮是最常用的冷卻劑，因而要求所使用的溶劑在液氮溫度下應具有足夠的黏度并能形成明凈的剛性玻璃體，且對分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光譜區(qū)內沒有很強的吸收和發(fā)射，并容易制備和提純。

第4章分子發(fā)光光譜法4.4.2室溫磷光

固態(tài)基質表面室溫磷光分析：分析物通過物理吸附或某種化學作用力被束縛在固體基質表面，增大了剛性，減小了碰撞失活的概率，在嚴格干燥試樣的情況下限制了氧的猝滅作用，顯示室溫磷光。

膠束穩(wěn)定的室溫磷光分析：磷光體進入表面活性劑的膠束溶液中，微環(huán)境和定向約束力發(fā)生變化，減小內轉化和碰撞能量損失等非輻射失活過程概率，明顯增大三重態(tài)的穩(wěn)定性，使磷光強度顯著增大。

敏化室溫磷光分析第4章分子發(fā)光光譜法4.4.3磷光分析儀

熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。

測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。室溫測量時，不需要杜瓦瓶。第4章分子發(fā)光光譜法4.4.4磷光分析的應用第4章分子發(fā)光光譜法4.4.4磷光分析的應用第4章分子發(fā)光光譜法4.5化學發(fā)光分析

化學發(fā)光是由化學反應提供的能量激發(fā)物質所產生的光輻射。生物發(fā)光是指產生于生物體系中的化學發(fā)光?；谶@類發(fā)光現(xiàn)象的分析方法，稱為化學發(fā)光（或生物發(fā)光）分析法。

優(yōu)點：(1).靈敏度很高。(2).儀器設備簡單，無須光源和單色器，因而也消除了散射光和雜散光的干擾；(3).線性范圍寬；(4).分析速度快。

局限：目前可供應用的發(fā)光體系尚有限，發(fā)光機理有待進一步研究，方法的選擇性有待進一步提高。

第4章分子發(fā)光光譜法

在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；（2）化學發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行；

化學發(fā)光反應存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。4.5.1化學發(fā)光分析原理第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學發(fā)光反應類型1.直接化學發(fā)光A+B=C*+DC*

→C+h第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學發(fā)光反應類型2.間接化學發(fā)光第4章分子發(fā)光光譜法4.5.2化學發(fā)光反應類型3.液相化學發(fā)光

發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；光澤精等

該發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子（如Fe2+,Cu2+

等）可催化反應；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。魯米諾在堿性溶液