動物細(xì)胞融合

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目:動物細(xì)胞融合

小組成員：覃科（1310750171）張?zhí)煲悖?310750175）袁建俠（1310750179）吳金寶（1310750180）目錄1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、實(shí)驗(yàn)原理3、實(shí)驗(yàn)步聚4、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果5、融合過程觀察以及融合率的計(jì)算6、實(shí)驗(yàn)試劑及材料7、注意事項(xiàng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解PEG誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合的原理2、初步掌握細(xì)胞融合技術(shù)及融合率的計(jì)算方法。動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合又稱細(xì)胞雜交，是兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并形成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程。用人工方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的新興技術(shù)，發(fā)展速度非?？?，應(yīng)用范圍極為廣泛，已成為廣泛，已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤及生物新品種培育的重要手段。二、實(shí)驗(yàn)原理人工合成形成的融合細(xì)胞有兩類：

由不同親本細(xì)胞融合而來由同一親本細(xì)胞融合而來異核體同核體3、誘導(dǎo)方式物理法：化學(xué)法：生物法：滅活的病毒電激、振動、離心聚乙二醇（PEG）例如：仙臺病毒目前應(yīng)用最廣泛的是PEG，因?yàn)镻EG易得、簡便，且融合性效果好。PEG可借氫鍵與H2O結(jié)合，高濃度的PEG溶液易使細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致細(xì)胞融合。滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動性）4.生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）過程：細(xì)胞融合的應(yīng)用搞科研三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、50%PEG液的制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，稱取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度離心管內(nèi)，用試管夾夾住，在酒精燈焰上加熱，使其溶化，冷卻至50~60°C時(shí)，加入預(yù)熱的等體積Hanks液混勻，置之37℃水浴箱中保溫待用。實(shí)驗(yàn)操作流程（一）50%PEG液的制備取一定量PEG放入刻度離心管內(nèi)在酒精燈火焰上加熱使其溶化待降至50~60°C時(shí)加入預(yù)熱的等體積Hanks液混勻置于37℃水浴箱中保溫待用（二）、融合方法：10%雞血細(xì)胞的制備

1、用肝素鈉處理后的注射器，在公雞翼下抽取2ml靜脈血，加入盛有8mlAlsever液的試管中，使血液：Alsever液的比例為1:4，混均后可在冰箱中存放一周。2、取雞血細(xì)胞懸液1ml到10ml離心管，加入9ml

0.85%生理鹽水混勻，1000r/min離心5min，棄上清液，再按照上述條件離心洗滌2次。3、收集沉淀細(xì)胞，加入8ml~10mlHanks液配置成10%的雞血細(xì)胞懸液。取10%的雞血細(xì)胞懸液1ml加入離心管中加入8—10mlHanks液傾去上清液，將離心管倒置于濾紙上取50%PEG

0.5ml加入5mlHanks液混勻放入離心機(jī)中

1000r/min離心5min傾去上清液再次懸浮細(xì)胞離心洗滌一次手指輕彈離心管在37℃水浴中于1min內(nèi)逐滴入離心管加入9mlHanks在37℃水浴中靜置5min稀釋PEG齊去上清液在37℃水浴中溫浴20~30min加2-3mlHanks液在5min10min20min30min去懸液制片用0.2%亞甲基藍(lán)染色觀察四、預(yù)期結(jié)果：

（一）融合過程觀察：分別于溫育5min、10min、15min、20min、30min取細(xì)胞懸液一滴制成臨時(shí)裝片，以0.2%次甲基藍(lán)染液染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合的不同階段，通?？砂讶诤线^程大致分為5個(gè)階段：細(xì)胞融合過程圖五個(gè)階段兩個(gè)細(xì)胞的膜相互接觸，粘連。相接的兩細(xì)胞膜破口粘合形成細(xì)胞膜通道。兩細(xì)胞之間細(xì)胞質(zhì)相遇，形成細(xì)胞質(zhì)通道。通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體。細(xì)胞合并完成，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。

（注：上述階段可在不同時(shí)期觀察）五、融合率的計(jì)算：

融合率是指在顯微鏡視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞，其細(xì)胞核的總數(shù)與視野內(nèi)所有細(xì)胞（包括已融合和未融合細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比。對孵育30min時(shí)制備的臨時(shí)裝片計(jì)算融合率。通常以百分?jǐn)?shù)表示，進(jìn)行多個(gè)視野測定值的平均統(tǒng)計(jì)更加準(zhǔn)確。

融合率=（融合的細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)）×100%六、實(shí)驗(yàn)試劑及材料1、材料：成年健康公雞。2、試劑：聚乙二醇（PEG，Mr=4000）、0.2%亞甲基藍(lán)染液、Alsever液、0.85%生理鹽水、Hanks液。3、儀器設(shè)備：顯微鏡、恒溫水浴箱、離心機(jī)、電子天平、刻度離心管、試管、試管架、酒精燈、量筒、吸管、載玻片、蓋玻片、注射器、燒杯。七、注意事項(xiàng)：

1、1.在離心管中加PEG之前，一定要將離心管倒置濾紙上，流盡