動物疫病監(jiān)測的采樣技術(shù)(潘)

重大動物疫病采樣技術(shù)

潘國利縣動物疫病預(yù)防控制中心

重大動物疫病采樣技術(shù)

一、畜禽血液和病料采集技術(shù)（一）畜禽血液采集技術(shù)（二）畜禽病料采集技術(shù)

一、畜禽血液采集技術(shù)（1）（一）、血樣采集要求1、所有采血用具均應(yīng)事先以消毒、干燥處理；2、采血部位要進行剪毛、清拭并按常規(guī)進行消毒（先碘酊后酒精）；3、懷疑傳染病時，采血過程要防止到處流散，檢后的殘余血液及所用器皿要進行消毒處理；4、需抗凝的要加入抗凝劑。常用的抗凝劑有：一、畜禽血液采集技術(shù)（2）①雙草酸鹽抗凝劑：草酸鉀0.6克；草酸銨1.2克；蒸餾水加至100毫升，溶解后，吸取0.5毫升，加入供采血用的試管或小瓶中，置干燥箱內(nèi)（溫度不能超過80℃），烘干備用（實際含草酸鹽10毫克，可供5毫升全血抗凝用）；②枸櫞酸鈉6mg可使1ml血液不凝固，或配成3.8%的溶液。適用于血鈣的測定和血沉測定時的抗凝；一、畜禽血液采集技術(shù)（3）③乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉）每10毫克可使5毫升全血抗凝；或配成10%的溶液，每2滴可使5毫升全血抗凝；④肝素對血中有機成分和無機成分測定均無影響，多用于科研。常用肝素鈉配成1ml內(nèi)含1mg(0.1%)的水溶液，取0.1ml分裝于小試管或小青霉素瓶中，在80℃以下烤干后備用，可使5～10ml血液不凝固。一、畜禽血液采集技術(shù)（4）5、需分離血清的血液（不抗凝），試管要靜置、斜放，便于血清晰出；6、注意安全。一、畜禽血液采集技術(shù)（5）（二）牛靜脈血液的采集1、頸靜脈采血器械：酒精、碘酊藥棉；5ml或10ml試管，試管架；12～16＃針尖；毛剪、止血鉗、鑷子；3～4米細繩1根。保定：站立保定。一、畜禽血液采集技術(shù)（6）助手：至少2人。部位確定：一般在頸靜脈溝的上1/3和中1/3交界處的頸靜脈內(nèi)（兩側(cè)均可）。頸靜脈溝位于頸下側(cè)，由臂頭肌和胸頭肌形成的一肌溝，外表肉眼可見。牛頸靜脈位置如下圖示：操作：助手保定好牛頭。先看（摸）清頸靜脈溝，確定部位，局部剪毛（看不清時）、消毒。以左手拇指（于左側(cè)操作時）或中指和無名指（于右側(cè)操作時）按壓頸靜脈溝的中下部，或一、畜禽血液采集技術(shù)（7）讓助手用細繩橫勒頸中下部，稍等片刻，讓頸靜脈充分怒張，右手持針頭在注射點按靜脈走向，與靜脈呈45°角斜向迅速刺入。若牛皮較厚，指力有限，用此法常感困難時，可手持針頭，依靠腕力把針頭朝靜脈方向快速地垂直刺入，當刺入靜脈內(nèi)，立見回血，即可用試管接之。若針頭偏離靜脈（未見回血），可將針頭稍稍退出或拔至皮下，在認清靜脈一、畜禽血液采集技術(shù)（8）走向后重新刺入。一般來說，只要刺入靜脈，針頭內(nèi)滴出之血液可有5～10毫升，若滴出之血液量較少或較慢，可用手指按壓頸靜脈中下端片刻即可。采血完畢，迅速拔出針頭，用碘酊棉球按壓針孔片刻即結(jié)束。頸靜脈血液的采集圖片一、畜禽血液采集技術(shù)（9）2、尾靜脈采血器械同上。

保定：站立保定。部位確定：尾根腹側(cè)中部。操作：助手立于牛的右側(cè)，將尾聲輕輕抬起，使之基本與地面平行，采血者立于牛的左一、畜禽血液采集技術(shù)（10）側(cè)，手持裝有針頭的注射器，使針頭與尾椎縱軸成45°角，向上向前方刺入約1～2cm，邊刺邊旋動注射器活塞，見血即可。采血完畢，迅速拔出針頭，局部按壓、消毒。

尾靜脈采血一、畜禽血液采集技術(shù)（11）（三）豬靜脈血液的采集

1、耳靜脈采血（多用于大豬采血）器械準備：酒精、碘酊藥棉；5ml或10ml試管，試管架；毛剪、止血鉗、鑷子；配7＃針尖的一次性注射器。保定：左側(cè)（或右側(cè)）橫臥保定。

一、畜禽血液采集技術(shù)（12）部位確定：耳下緣1/2處。操作：耳靜脈局部常規(guī)消毒處理。助手用手指捏壓耳根部靜脈血管，使靜脈充盈、怒張。術(shù)者用左手的食指和中指在耳下將耳上托，拇指在上部把注射點皮膚展平，右手持注射器把針頭對準血管（針頭與血管成30～45°角）刺入，當初步判定針尖已刺入血管后，將注射器一、畜禽血液采集技術(shù)（13）放平，順血管走向伸入（此時感覺針尖阻力明顯減?。?，同時抽動注射器活塞，慢慢抽取血液。如血管內(nèi)血量較少，助手可用手指自耳根向耳尖部擠抹。采血完畢，迅速拔出針頭，局部用干燥棉球按壓止血。

一、畜禽血液采集技術(shù)（14）2、前腔靜脈采血器械準備：酒精、碘酊藥棉；5ml或10ml試管，試管架；毛剪、止血鉗、鑷子；配7＃長針尖的一次性注射器。保定：仰臥保定，兩前肢與體中線垂直，兩后肢后引，頭部貼地，使前腔靜脈怒張。熟練時也可取半仰臥、側(cè)臥或站立保定。一、畜禽血液采集技術(shù)（15）部位確定：刺入點右側(cè)或左側(cè)胸淺窩內(nèi)，即在第一肋骨和胸骨柄（胸骨的前端）結(jié)合處前方。亦有人刺入點定位于耳根與胸骨柄連線上，胸骨柄前1～2指寬處。操作：右手持針，針頭斜向?qū)?cè)或向后內(nèi)方（與胸骨縱軸基本成45°角），與地面成60°角，刺入2～5cm深（視豬只的大小定），針頭向刺入的同時，微微抽動活塞，使注射器形一、畜禽血液采集技術(shù)（16）成負壓，一旦進入前腔靜脈，立見血液涌入注射器。完畢后常規(guī)消毒。需要說明的是，刺入點一般取右側(cè)，因左側(cè)靠近膈神經(jīng)而易損傷。采血圖片前腔靜脈采血圖片前腔靜脈采血圖片一、畜禽血液采集技術(shù)（17）家禽血樣的采集

1、雞翅內(nèi)側(cè)靜脈采血器械準備：酒精棉球；小試管或細塑料管，試管架；鑷子；配5～7＃針尖的一次性注射器。一、畜禽血液采集技術(shù)（17）保定：手提保定。助手一手抓住兩只雞腿，一手抓雞翅根部，以拇指按壓靜脈管。部位確定：雞翅內(nèi)側(cè)腋靜脈，肉眼可見。操作：助手抓住雞翅根部，以拇指按壓靜脈管，使之充盈。術(shù)者左手大拇指捏住雞翅內(nèi)側(cè)，余四指捏住雞翅外側(cè)，展平雞翅，右手持針，沿血管方向，于血管傍先刺入皮下，然后

一、畜禽血液采集技術(shù)（18）再斜刺向血管，抽取血液（此法避免拔針后出血過多）。也可直接刺向血管，抽取血液（采用此法，拔針后要用干棉球按壓數(shù)分鐘止血）?；蛘邔㈦u翅擺平，直接先將靜脈用針刺破，待血液流出后，用細塑料管利用虹吸的原理吸取血液，事畢，用火將細塑料管一頭封閉。雞翅內(nèi)側(cè)靜脈采血圖片一、畜禽血液采集技術(shù)（19）2、雞心臟采血方一操作要點：雞左側(cè)向上橫臥保定，拔去胸上部部分羽毛，尋找由胸骨走向肩胛的皮下大靜脈，心臟約在該靜脈的分支下側(cè)，有時用食指可摸到心臟跳動。用酒精消毒后，以碘酊標記部位。針頭（7＃）刺入時，如觸及胸骨可稍拔出，使針頭稍向右偏，避開胸骨，再將針頭向里刺入，邊刺邊抽動活塞，若刺入心臟，便有血液涌入注射器，術(shù)畢，局部消毒。一、畜禽血液采集技術(shù)（20）方二操作要點：雞仰臥保定，雞頭部朝向術(shù)者，拔去胸上部少許羽毛，用手指在胸骨上方、嗉囊下方摸得一凹窩，右手持針（7＃），自胸骨上方凹窩斜向前下方心臟方向（雞的左側(cè)、術(shù)者的右側(cè)）刺入，邊刺邊抽動活塞，若刺入心臟，便有血液涌入注射器，術(shù)畢，局部消毒。注意：此法（含方法1、2）采血后，多會引起雞只死亡，僅適用于淘汰雞的采血。一、畜禽血液采集技術(shù)（21）3、雞頭部靜脈竇采血器械準備：酒精或碘酊棉球；小試管，試管架；鑷子；配5－7＃短針尖的一次性注射器。保定：助手一手抓雞的兩只腿，一手抓雞的兩翅，使頭部向上。術(shù)者左手食指和中指夾住雞喙，大拇指壓住頸上部，以此固定頭部。部位確定：雞頭后部，枕骨大孔為刺入點。一、畜禽血液采集技術(shù)（22）操作：雞只如上述方法確切保定后，枕骨大孔部少許拔毛，消毒，術(shù)者右手持針，自枕骨大孔進針，針頭對準喙尖，約與頸椎縱軸成45°角，刺入約0.5～0.8cm（視雞只大小），刺入靜脈竇后，針頭感覺無阻力，抽取血液，術(shù)畢消毒。注意：此法采血后，亦會引起雞只死亡，故適用于淘汰雞的采血。苗雞采血亦可用此法。一、畜禽血液采集技術(shù)（23）（五）羊靜脈血樣的采集

1、頸靜脈采血器械準備：酒精或碘酊棉球；小試管，試管架；鑷子；配7＃長針尖的一次性注射器。保定：站立保定。保定需2人。一人立于羊的左側(cè)前方，左手托住羊的下頷，右手抱住羊的耳根部，使頭上揚并貼住術(shù)者身體。另一人產(chǎn)于羊的后方，用兩手穩(wěn)住羊的臀部，避免左右走動。一、畜禽血液采集技術(shù)（24）部位確定：同牛。一般在羊右側(cè)頸中上部。操作：術(shù)者蹲于羊的右側(cè)，左手大拇指按壓頸下部頸靜脈的近心端片刻，使頸靜脈怒張，剪毛，酒精消毒后，以碘酊標記部位。右手持針，針頭與頸靜脈成30～45°角，順靜脈方向刺入，抽取血液。術(shù)畢，消毒按壓止血。一、畜禽血液采集技術(shù)（25）2、前腔靜脈采血方法基本與豬前腔靜脈采血同。此法適用于羔羊。二、畜禽病料采集技術(shù)（1）

（一）樣品采集的原則：采集檢測樣品是診斷檢測工作的重要內(nèi)容。采樣的時機是否適宜，樣品是否具有代表性，樣品處理、保存、運送是否合適及時，與檢驗結(jié)果的準確性、可靠性關(guān)系極大。采集樣品時，需要符合以下規(guī)定：

二、畜禽病料采集技術(shù)（2）適時采樣。根據(jù)檢測要求及檢測對象和檢驗項目的不同，選擇適當?shù)牟蓸訒r機十分重要。樣品是有時間要求的，應(yīng)嚴格按規(guī)定時間采樣，有臨床癥狀需要作病原分離的，樣品必須在病初的發(fā)熱期或癥狀典型時采樣，病死的動物，應(yīng)立即采樣。二、畜禽病料采集技術(shù)（3）合理采樣。根據(jù)診斷檢測的要求，須嚴格按照規(guī)定采集各種足夠數(shù)量的樣品外，不同疫病的需檢樣品各異，應(yīng)按可能的疫病側(cè)重采樣。對未能確定為何種疫病的，應(yīng)全面采樣。典型采樣。選取未經(jīng)藥物治療、癥狀最典型或病變最明顯的樣品，如有并發(fā)癥，還應(yīng)兼顧采樣。二、畜禽病料采集技術(shù)（4）無菌采樣。采集檢驗樣品除供病理組織學(xué)檢驗外還供病原學(xué)及血清學(xué)檢驗，供病原學(xué)及血清學(xué)檢驗的樣品，必須無菌操作采樣，采樣用具、容器均須無菌處理，尸體剖檢需采集樣品的，先采樣后檢查，以免人為污染樣品。適量采樣。采集樣品的數(shù)量要滿足診斷檢測的需要，并留有余地，以備必要時復(fù)檢使用。二、畜禽病料采集技術(shù)（5）樣品處理。采集的樣品應(yīng)一種樣品一個容器，立即密封，根據(jù)樣品的性狀檢驗要求的不同，作暫時的冷藏、冷凍或其它處理。供病毒學(xué)檢驗的樣品，數(shù)小時內(nèi)要送到實驗室，只作冷藏處理，超過數(shù)小時的要冷凍處理，（凍結(jié)方法：可將樣品放入-30℃冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后再裝入有大小冰塊或干冰的冷藏瓶（箱）內(nèi)運送，亦可將裝入樣品的容器放入隔熱二、畜禽病料采集技術(shù)（6）保溫瓶內(nèi)，再放入冰塊，然后按100ｇ冰塊加入食鹽約35克，立即將隔熱保溫瓶瓶口塞緊。瓶內(nèi)溫度可達-21℃左右）。供細菌學(xué)檢驗或血清學(xué)檢驗的樣品，冷藏送實驗室即可。裝樣品的容器應(yīng)貼上標簽，標簽要防止因凍結(jié)而脫落，標簽標明采集的時間、地點、號碼和樣品名稱，并附上發(fā)病、死亡等相關(guān)資料，盡快送實驗室。二、畜禽病料采集技術(shù)（7）安全采樣。既要保護采樣人員，以要防止病原外泄，還要防止樣品受到污染。8、樣品包裝。主要是密閉，防止樣品損壞、污染和外泄等意外發(fā)生。9、迅速送檢。應(yīng)盡快送實驗室進行檢測，延誤送檢時間，會影響到檢測質(zhì)量和結(jié)果的可靠性。二、畜禽病料采集技術(shù)（8）（二）血液樣品的采集

1、病毒檢驗用血液樣品。應(yīng)在動物發(fā)病初體溫升高期采集。血液樣品必須是脫纖血或是抗凝血?？鼓齽┛蛇x用肝素或EDTA，枸緣酸鈉對病毒有輕微毒性，一般不宜采用。采血前，在真空采血管或其它容器內(nèi)按每毫升血液加入0.1%肝素1ml或EDTA20mg。采集的血液立即與抗凝劑充分混合，防止凝固。采脫纖血時，先在容器內(nèi)加入適二、畜禽病料采集技術(shù)（9）量小玻璃珠，加入血液后，反復(fù)振蕩，以便脫去血液纖維。采集的血液經(jīng)密封后貼上標簽，以冷藏狀態(tài)立即送實驗室。必要時，可在血液中按每毫升加入青霉素和鏈霉素各500～1000IU，以抑制血源性可采血中污染的細菌。二、畜禽病料采集技術(shù)（10）2、細菌檢驗樣品。采血應(yīng)在動物發(fā)病初體溫升高或發(fā)病期，未經(jīng)藥物治療期間采集。血液應(yīng)脫纖或加肝素抗凝劑(或EDTA或枸緣酸鈉)，但不可加入抗生素。采集的血液經(jīng)密封后貼上標簽，以冷藏狀態(tài)立即送實驗室，否則須置4℃冰箱內(nèi)暫時保存，但時間不宜過久，以免溶血。二、畜禽病料采集技術(shù)（11）3、血清學(xué)檢驗樣品。用作血清學(xué)檢驗的樣品不加抗凝劑或脫纖處理。為保障血清質(zhì)量，一般情況下，空腹采血較好。采集的血液貼上標簽，室溫靜置待凝固后送實驗室，并盡快將自然析出的血清或經(jīng)離心分離出的血清吸出，按需要分裝，再貼上標簽冷藏保存?zhèn)錂z。較長時間才檢驗的，應(yīng)凍結(jié)保存，但不能反復(fù)凍融，否則抗體效價下降。作血清學(xué)檢驗的血液，在采血、運送、分離血清過程中，應(yīng)避免溶血，以免影響檢驗結(jié)果。采集雙份血清檢二、畜禽病料采集技術(shù)（12）測比較抗體效價變化的，第一份血清采于發(fā)病的初期并作凍結(jié)保存，第二份血清采于第一份血清后3～4周，雙份血清同時送實驗室。4、寄生蟲檢驗樣品。因不同的血液寄生蟲在血液中出現(xiàn)的時機及部位各不相同，因此需要根據(jù)各種血液寄生蟲病的特點，取相應(yīng)時機及部位的血液制成血涂片，送實驗室。二、畜禽病料采集技術(shù)（13）（三）組織樣品的采集組織樣品一般由撲殺動物或病死尸體剖中采集。從尸體采樣時，先剝?nèi)游镄馗共科つw，以無菌器械將腹腔打開，根據(jù)檢驗?zāi)康暮蜕耙卟〉某醪皆\斷，無菌采集不同的組織。二、畜禽病料采集技術(shù)（14）1、病毒檢驗樣品。作病毒檢驗的組織，必須以無菌技術(shù)采集，組織應(yīng)分別放入滅菌的容器內(nèi)并立即密封，貼上標簽，放入冷藏容器立即送實驗室。如果時間較長，可作凍結(jié)狀態(tài)運送，也可將組織塊浸泡在PH7.4左右的乳漢液或磷酸緩沖肉湯保護液內(nèi)，并按每毫升保護液加入青霉素、鏈霉素各1000IU，然后放入冷藏容器內(nèi)送實驗室。二、畜禽病料采集技術(shù)（15）2、細菌檢驗樣品。供細菌檢驗的組織樣品，應(yīng)新鮮并以無菌技術(shù)采集。如遇尸體已經(jīng)腐敗，某些疫病的致病菌仍可采集于長骨或肋骨，從骨髓中分離細菌。采集的所有組織分別放入滅菌的容器內(nèi)并立即密封，貼上標簽，放入冷藏容器立即送實驗室。二、畜禽病料采集技術(shù)（16）（四）糞便樣品的采集

1、病毒檢驗樣品。分離病毒的糞便必須新鮮。少量采集時，以滅菌的棉拭子從直腸深處或泄殖腔粘膜上蘸取糞便，并立即投入滅菌的試管內(nèi)密封，或在試管內(nèi)加入少量PH7.4的保護液再密封。貼上標簽冷藏送實驗室。2、細菌檢驗樣品。作細菌檢驗的糞便，最好在動物使用抗菌藥物之前，從直腸或泄殖腔粘膜上采集二、畜禽病料采集技術(shù)（17）采樣方法與供病毒檢驗的相同?？赏度霟o菌緩沖鹽水或肉湯的指形管內(nèi)，貼上標簽冷藏送實驗室。3、寄生蟲檢驗樣品。糞便樣品應(yīng)選取新排出的或直接從直腸內(nèi)采得，以保持蟲體或蟲體節(jié)片及蟲卵的固有形態(tài)，一般寄生蟲檢驗的糞便用量較多。采得的糞便以冷藏不凍結(jié)狀態(tài)送實驗室。

二、畜禽病料采集技術(shù)（18）（三）幾種畜禽疫病的樣品采集1、口蹄疫樣品的采集、保存和運送口蹄疫病毒在病畜的水皰皮內(nèi)及其淋巴液中含毒量最高。在水皰發(fā)展過程中，病毒進入血流，分布到全身各種組織和體液。在發(fā)熱期血液內(nèi)的病毒含量最高，退熱后在奶、尿、口涎、淚、糞便等都含有一定量的病毒。二、畜禽病料采集技術(shù)（19）（1）組織樣品樣品的選擇。用于病毒分離、鑒定的樣品以發(fā)病動物(牛、羊或豬)未破裂的水泡皮和水泡液為最好。對臨床健康但懷疑帶毒的動物可在撲殺后采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品作為檢測材料。二、畜禽病料采集技術(shù)（20）樣品的采集和保存.樣品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭)，剪取病畜的新鮮水泡皮3～5克放入滅菌小瓶中，加適量50％甘油／磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，加蓋密封；也可采用無菌器具采集水泡液至少1毫升，裝入滅菌小瓶中(可加適量抗菌素)，加蓋密封。盡快冷凍保存。二、畜禽病料采集技術(shù)（21）在無法采集水泡皮和水泡液時，可采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品3～5克裝入潔凈小瓶內(nèi)，加蓋密封盡快冷凍保存。樣品的包裝瓶上均要貼上標簽，寫明采樣地點，動物種類，編號，時間等。二、畜禽病料采集技術(shù)（22）（2）牛、羊食道—咽部分泌物(O—P液)樣品

樣品采集。被檢動物在采樣前禁食(可飲水)12小時，以免胃內(nèi)容物反流污染O—P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0．2％檸檬酸或2％氫氧化鈉浸泡5分鐘，再用潔凈水沖洗。每采完一頭動物，探杯要重復(fù)進行消毒并充分清洗。采樣時動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部10～15cm處，輕輕來回移動2～3次，然后將探杯拉出。二、畜禽病料采集技術(shù)（23）樣品的保存將采集到的8～10mLO—P液倒入25mL以上的滅菌玻璃容器中，容器中應(yīng)事先加有8～10mL細胞培養(yǎng)液或磷酸緩沖液(0.04mol／L、pH7．4)，密封后充分搖勻后盡快冷凍保存，用于病原檢測，做出追溯性診斷。二、畜禽病料采集技術(shù)（24）血清懷疑曾有疫情發(fā)生的畜群，錯過組織樣品采集時機時，可無菌操作采集動物血液，每頭不少于10mL。無菌分離血清裝入滅菌小瓶中，加蓋密封后冷藏保存，通過檢測抗體，做出追溯性診斷。采集樣品時要填寫樣品采集登記表(見附表4)。二、畜禽病料采集技術(shù)（25）裝樣玻璃容器必須密封，即防水又不透氣。樣品容器需加貼防水標簽，并寫明樣品編號、采集地點、動物種類、時間等。樣品運送。運輸前將樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應(yīng)填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專用運輸容器中。專用運輸容器應(yīng)隔熱堅固，內(nèi)裝適當冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標志。二、畜禽病料采集技術(shù)（26）禽流感的樣品采集、保存和運輸

病毒主要在呼吸道粘膜細胞內(nèi)增殖。病禽至少從5只瀕死禽采集樣品。樣品包括：泄殖腔拭子和氣管拭子(置于緩沖液中)各5個(小珍禽可采集新鮮糞便)；氣管和肺的混樣二、畜禽病料采集技術(shù)（27）5個，腸管及內(nèi)容物的混樣5個；肝、脾、腎和腦等組織樣品(不能混樣)各5個。采集方法：1)泄殖腔棉拭子：將棉拭子插入肛門并旋轉(zhuǎn)，使糞便沾在拭子上，后放在運輸緩沖液中。2)氣管棉拭子：活雞采樣時，將棉拭子插入活雞的氣管內(nèi)，輕輕擦拭氣管壁并放入緩沖液中。死亡動物采氣管樣品二、畜禽病料采集技術(shù)（28）時，可在肺和氣管離體情況下進行采集，應(yīng)將棉拭子插入較深部位用力擦拭，并按上述方法將棉拭子放在運輸緩沖液中。3)糞便樣品：可從活禽市場采取新鮮糞便，用棉拭子沾取糞便，并將采好的樣品放在運輸緩沖液中。二、畜禽病料采集技術(shù)（29）分別采集至少10個病雞的血樣