zwj多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

溫故知新1:組成DNA分子的基本單位是什么?這些基本單位是如何連接成DNA分子的?DNA分子結構有什么特點？12345堿基OHOOPOHOOHOOPOHO堿基OHOH15243OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結構簡圖磷酸二酯鍵5’5’3’3’DNA分子的復制過程是怎樣的？DNA分子的復制需要哪些條件？溫故知新2DNA母鏈：提供復制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸(一小段RNA)DNA復制的條件1、PCR（多聚酶鏈式反應）技術：是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。2、原理：利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。一、基礎知識

（一）PCR原理：DNA母鏈：提供復制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸(一小段RNA)3、PCR反應的條件80—100℃：耐熱的DNA聚合酶：緩沖溶液：維持反應的pH值不變(一般是一小段單鏈DNA)(二)PCR反應的過程1、變性：溫度上升到90℃以上時,雙鏈DNA解聚成為單鏈。2、復性（退火）： 溫度下降到50℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。3、延伸： 溫度上升到72℃左右,溶液中的4種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補配對的原則合成新的DNA鏈。PCR循環(huán)第一步：加熱變性:雙鏈DNA解聚成為單鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列復性（退火）:引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸:合成新的DNA鏈靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量4、PCR循環(huán)的結果②DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸。二、實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器。2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml。3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。PCR儀微量離心管微量移液器1、準備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4、離心5、反應②離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。循環(huán)數(shù)變性復性延伸預變性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭。（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為：2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為：a2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關。2、過程①稀釋2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋。②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。③計算④計算DNA含量（g

）＝50x（260nm的讀數(shù)）x稀釋倍數(shù)公式中50的含義：50g/ml的DNA在標準厚度為1cm比色杯中的吸光值為1。比色杯四、課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技