對甘油制備1,3-丙二醇工藝進(jìn)行設(shè)計

對甘油制備1,3-丙二醇工藝進(jìn)行設(shè)計-發(fā)酵法制備1,3-丙二醇摘要：本設(shè)計以甘油為原料，在無氧條件下，利用克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，符合綠色化學(xué)的特點。通過測定菌體生物量、葡萄糖濃度、蛋白質(zhì)濃度、甘油脫水酶、丙醛的濃度，可以初步判定發(fā)酵進(jìn)行程度。設(shè)計實驗對克雷伯氏菌發(fā)酵特性進(jìn)行研究，分別研究溫度、PH、甘油初始濃度、氮源對菌體生長和1,3-PD合成的影響。關(guān)鍵詞：1,3-丙二醇、甘油、克雷伯氏菌、厭氧發(fā)酵1前言1,3-丙二醇(1,3-PD)是一種重要的化工原料，它可作為化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)中多種潤滑劑、有機溶劑和前體的合成原料。它作為聚酯、聚醚和聚氨酯的重要單體原料合成的聚合物具有生物可降解性、安全無毒、可循環(huán)利用等優(yōu)點，不僅在服裝和工程塑料領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域也開始嶄露頭角。以1,3-丙二醇為原料合成的食品添加劑丙二醇酯，是世界六大食品乳化劑之一，目前已被美國、日本和中國等國家及歐盟，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)使用。20世紀(jì)90年代中期,工業(yè)上成功開發(fā)出了以1,3-PD為原料的新型聚酯材料-聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT),PTT性能優(yōu)良,因此研究開發(fā)低成本的1,3-PD生產(chǎn)技術(shù)成為關(guān)注的熱點。1,3-PD的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。生物法合成1,3-PD符合“綠色化學(xué)”的特點，利用甘油或葡萄糖等可再生資源為原料，生產(chǎn)清潔，對環(huán)境無污染，符合我國可持續(xù)發(fā)展的需要。近幾年，隨著以大豆油與菜籽油為原料生產(chǎn)生物柴油產(chǎn)量的迅速增長，產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物甘油；用甘油合成附加值更高的1,3-丙二醇有利于資源的綜合利用，引起了如杜邦公司、陶氏化學(xué)公司、亨斯邁公司等公司的關(guān)注。發(fā)酵工程作為生物法合成1,3-PD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)更是人們關(guān)注的熱點。2003年美國環(huán)境保護(hù)機構(gòu)向杜邦授予“綠色化學(xué)總統(tǒng)獎”，專門用于表彰該公司對生物基1,3-PD工藝開發(fā)所作的研究。21,3-丙二醇(1,3-PD)的概述2.11,3-丙二醇(1,3-PD)的基本性質(zhì)1,3-丙二醇(1,3-PD)無色無味，易溶于水、乙醇和多種有機溶劑，微溶于氯仿和甲苯，是一種重要的化工原料。與其它二元醇相比，1,3-PD具有更高的沸點和更低的熔點（見表1-1）。表1-11,3-丙二醇與其他二醇的性質(zhì)比較性質(zhì)乙二醇1,2-丙二醇1,3-丙二醇熔點（℃）8.5-59-27沸點（℃）116118216密度（）08981.0361.060其化學(xué)性質(zhì)體現(xiàn)了醇和二元醇的典型性質(zhì)可與羧酸縮合成酯，與異腈酸鹽及酸性氯化物反應(yīng)生成聚氨酯，與二元酸反應(yīng)生成聚酯。由1,3-PD制得的聚合物易于生物降解，對環(huán)境友好。關(guān)于1,3-PD的生物毒害作用，早期報道1,3-PD對哺乳動物具有低水平的毒性，大鼠LD50大約是10g/kg，兔子LD50大約是4.2g/kg。但是最近Gingell對大鼠的研究表明，長期的1,3-PD攝入（1000mg/kg·day）并沒有對大鼠產(chǎn)生毒害作。2.21,3-丙二醇的主要用途1,3-PD由于其對稱性的三碳結(jié)構(gòu)被用作許多化合物和聚合物的合成，可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)，也可用于抗凍劑、增塑劑、乳化劑等的合成原料。（1）作為中間體用于食品、化妝品和制藥等領(lǐng)域。以1,3-PD為原料合成的丙二醇酯是一類食品添加劑，其作為世界六大食品乳化劑之一，目前已被美國，日大等國家及聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)使用。由1,3-丙二醇合成的聚合物由于具有生物可降解性、安全無毒以及耐油、耐老化等許多其它二元醇合成塑料所不具有的優(yōu)良特性，在食品包裝材料具有廣泛的應(yīng)用前景。以1,3-PD為基礎(chǔ)合成的2-氨基-1,3-丙二醇及其衍生物可以預(yù)防或治愈移植接受者的急性或慢性排斥反應(yīng)，并可預(yù)防或治愈由于移植引發(fā)的血管疾病。非氨酯中間體2-苯基-1,3-丙二醇作為新一代抗癲癇藥，也正得到越來越多的應(yīng)用。（2）作為單體用于合成聚酯、聚氨酯等聚酯材料。以1,3-PD為單體合成的聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）由于具有回彈性好、易染色等比聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚對苯二甲酸丁二醇酯（PBT）等合成纖維更優(yōu)良的特性，在地毯、服裝面料、工程塑料和薄膜制造方面均有較好的應(yīng)用前景1998年，PTT被美國評為六大石化新品之一。作為二元醇，1,3-PD還能代替1,4-丁二醇和新戊二醇作為中間體，近來美國ChemSystems公司研究發(fā)現(xiàn)1,3-PD的二醇官能團(tuán)使其用于聚氨酯的生產(chǎn)具有很大潛力，可用于聚酯多元醇的生產(chǎn)和鏈增長劑。2.31,3-丙二醇的生產(chǎn)概況早在1948年,美國Shell公司就申請了以丙烯醛水合路線合成1,3-PD的專利，并于20世紀(jì)70年代實施了產(chǎn)業(yè)化。90年代中期荷蘭殼牌公司首先實現(xiàn)PTT商品化,商品名為Corterra,并開發(fā)了化學(xué)法生產(chǎn)1,3-PD的新工藝路線,年產(chǎn)量4,000ｔ從此激起全球PTT開發(fā)熱潮。而后，年產(chǎn)72,000t的裝置已于1999年12月在路易斯安那Geismar投入運營。德國Degussa公司1995年宣布已成功地開發(fā)出以丙烯醛為原料合成1,3-PD的新工藝，其成本與乙二醇大致相當(dāng)，并在比利時的Antwerp建成2000t/a中試裝置。1996年又建設(shè)了5萬t/a工業(yè)生產(chǎn)裝置，其產(chǎn)品用于生產(chǎn)新型聚酯纖維PTT和聚酯涂料。1998年美國杜邦公司從Degussa公司獲得了化學(xué)法生產(chǎn)技術(shù),但杜邦公司并不把化學(xué)法作為生產(chǎn)1,3-PD的主要方向,而傾向于用經(jīng)濟可行的生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行生產(chǎn),與世界第二大工業(yè)酶生產(chǎn)商Genencor國際有限公司申請了以可發(fā)酵碳源為底物用基因工程菌直接生產(chǎn)1,3-PD的專利基于這一創(chuàng)新，2003年美國環(huán)境保護(hù)機構(gòu)向杜邦授予“綠色化學(xué)總統(tǒng)獎”，專門用于表彰公司對生物基1,3-PD工藝開發(fā)所作的研究2004年6月20日，杜邦公司最新推出的以1,3-PD為主要原料生產(chǎn)的最先進(jìn)的高分子聚合物Sorona?。杜邦已宣布，將從2006年開始通過使用生物基1,3-PD來生產(chǎn)Sorona?，即所采用的1,3-PD將是用玉米糖發(fā)酵的生物技術(shù)而制備的。根據(jù)2006年7月4日ICIS報告顯示，Dupont公司與英國Tate&Lyle公司合作建成以玉米葡糖為原料年產(chǎn)45Kt/a的發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD裝置，已在美國田納西州洛頓市試運行。2.41,3-丙二醇的合成方法2.4.1環(huán)氧乙烷法生產(chǎn)1,3-丙二醇環(huán)氧乙烷法是荷蘭殼牌(Shell)等公司開發(fā)的一種新方法。該法包括兩步反應(yīng)，環(huán)氧乙烷（簡稱EO）首先與CO和氫氣進(jìn)行氫甲?；磻?yīng)生成3-羥基丙醛，后者再在一個固定床催化劑上7.5MPa～15MPa和100℃～200℃下加氫制得1,3-PD。總反應(yīng)式如下：EO＋CO＋2H2→1,3-PD。該工藝的特點是技術(shù)難度大，裝置投資高，但產(chǎn)品的質(zhì)量和成本有競爭力。2.4.2丙烯醛水合加氫法1,3-丙二醇丙烯醛法是Degussa公司開發(fā)的方法，也包括兩步反應(yīng)。第一步是在未透露的酸催化劑存在下，丙烯醛水合為3-羥基丙醛；第二步反應(yīng)實際與環(huán)氧乙烷法的第二步反應(yīng)相同。反應(yīng)式如下：第一步：丙烯醛水合為3-羥基丙醛CH2=CHCHO+H2O→HOCH2CH2CHO第二步：3-HPA催化加氫制得1,3-PDHOCH2CH2CHO+H2→HOCH2CH2CH2OH丙烯醛路線反應(yīng)條件比較溫和，技術(shù)難度也不大。但丙烯醛本身也是一種重要的有機中間體，而且屬劇毒易燃易爆物品，難以儲存和運輸。2.4.3生物法合成1,3-丙二醇自1881年AuhustFreund發(fā)現(xiàn)巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)能夠利用甘油合成1,3-PD以來，至今已發(fā)現(xiàn)多種微生物具有在厭氧或兼性厭氧條件下合成1,3-PD的能力，包括：克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiellapneumoniae）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)以及絮凝長桿菌（Enterobacteragglomerans）、乳桿菌屬的短乳桿菌（Lactobacillibrevis）和布氏乳桿菌(Lactobacillibuchneri)、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiabutyricum)和巴氏梭狀芽孢桿菌(Clostridiapasteuianu)等，其中克雷伯氏肺炎桿菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、弗氏檸檬菌因具有較高的1,3-PD轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強度，是研究的最多的三種菌。3材料與方法3.1材料3.1.1菌種實驗所用1,3-PD轉(zhuǎn)化菌KlebsiellapneumoniaeXJPD-Li從新疆特殊環(huán)境土樣中篩選得到,由石河子大學(xué)兵團(tuán)化工綠色過程重點實驗室。3.1.2試劑酵母浸膏、碳酸鈣、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化鈷、氯化錳、氯化鋅、硼酸、鉬酸鈉、氯化鎳、氯化銅、氯化銨、氯化鉀、硫酸鈉、氯化鎂、氯化鐵、氯化鈣、檸檬酸、氯化鈉、氫氧化鈉、甘油、輔酶I、1,4一二硫代蘇糖醇、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、1，2一丙二醇、檸檬酸鉀、鹽酸3一甲基一2苯并噻唑酮腙(MBTH)、維生素B12。3.1.3培養(yǎng)基(1)固體培養(yǎng)基（）：LB培養(yǎng)基，用于菌種保藏及活化。牛肉膏10，蛋白胨10，NaCl5，瓊脂17，pH7.0。(2)限制性培養(yǎng)基（）：用于菌株馴化。甘油20，硫酸銨6，NaCl1，pH7.0。(3)發(fā)酵（種子）培養(yǎng)基（）：見表2－1表2-1發(fā)酵（種子）培養(yǎng)基組成組分成分發(fā)酵培養(yǎng)基（）磷酸氫二鉀5.1磷酸二氫鉀1.5硫酸銨6.0硫酸鎂0.2氯化鈣0.02酵母粉1.0甘油20.0微量元素1.0鐵溶液2.03.1.4主要儀器與設(shè)備分光光度計721型、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱VIS一9140A、828型ThermoOrionpH計、電子天平CBP190S、超聲波細(xì)胞破碎儀UP50H、高速冷凍離心機3K30、4kl5超速低溫冷凍離心機、聯(lián)機紫外可見光分光光度計UV-2401(PC)S以及恒溫水浴裝置TB．85、DZX．40立式電熱滅菌鍋、HYG．II旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床柜、Spectrum756型紫外可見光分光光度計、HQ--60漩渦混合器。3.2實驗方法3.2.1搖瓶培養(yǎng)1）斜面培養(yǎng)：40℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，時間12h。2）微好氧種子培養(yǎng)：從活化的斜面上挑取菌苔，接入裝液量為50mL的150mL普通三角瓶，40℃水浴搖床培養(yǎng)12h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。3）發(fā)酵培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)：300ml厭氧培養(yǎng)搖瓶（圖2-1），裝液量100ml，接種量5%，40℃恒溫水浴搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，通入氮氣維持厭氧，通氣量0.2vvm。根據(jù)情況在培養(yǎng)4h、8h、12h補加一定量的甘油和堿，每隔一定時間取樣測定代謝產(chǎn)物和酶活變化情況。微好氧氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)搖瓶通入空氣，通氣比0.2vvm，其余條件同厭氧培養(yǎng)。3.3分析方法3.3.1菌體生物量的測定干重法測定菌體濃度：菌體濃度定義為單位體積菌液中所含菌體經(jīng)烘干至恒重時的重量，單位為g/L。取1.5mL小離心管置于80℃恒溫烘箱中烘干，在電子天平（1/10000）上準(zhǔn)確稱重，記錄為離心管初重。將發(fā)酵液充分搖勻，取1.0mL加入已稱重的離心管中，在5000rpm離心轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上清液，置于80℃烘箱中烘干至恒重，在電子天平上再次稱離心管重量，記為末重。末重與初重之差即為1mL發(fā)酵液中所含菌體細(xì)胞干重。菌體濃度（g/L）=菌體細(xì)胞干重/發(fā)酵液體積。濁度法測定菌體濃度：實驗中菌體濃度是通過測定菌液在650nm波長下的吸光度反映的。取一定量的菌液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，將稀釋的菌液置于玻璃比色皿中，以去離子水為參比，迅速測定其在650nm波長下的吸光度。實際菌體濃度=菌體濃度測定值×稀釋倍數(shù)。3.3.2葡萄糖濃度的測定葡萄糖濃度由SBA－40C生物傳感分析儀直接測定。SBA－40C生物傳感分析儀利用酶促反應(yīng)來定量，樣品分析的工作原理如下：樣品經(jīng)離心去除菌體后稀釋25倍，定量進(jìn)樣針吸取樣品25μl，注入反應(yīng)池。含有葡萄糖的樣品在樣品池內(nèi)迅速按一定比例混合均勻。葡萄糖透過酶膜圈的外層與固定化酶層接觸并反應(yīng)，反應(yīng)放出的再透過酶膜圈的內(nèi)層與白金－銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度呈線性比例關(guān)系，經(jīng)微機控制的信號可以直接顯示結(jié)果。3.3.3蛋白質(zhì)濃度的測定蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮藍(lán)法，牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。原理：考馬斯亮藍(lán)法是利用蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的原理定量測定蛋白質(zhì)濃度。考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使得染料的最大吸收峰位置由465nm變?yōu)?95nm，通過測定595nm處光吸收的增加量與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照即可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。考馬斯亮藍(lán)溶液：取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250染料溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%的磷酸溶液，用蒸餾水稀釋至1000ml。蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲液(1g/L)：用生理鹽水溶解牛血清白蛋白制成，冰箱保存。3.3.4丙醛濃度的測定丙醛是根據(jù)其與3-甲基－2－苯并咪唑腙（MBTH）顯色后在305nm處具有特征吸收峰測定的。配置不同濃度丙醛，取1mL與0.5mL0.1％的MBTH顯色15min后加入2mL蒸餾水稀釋，然后測定，丙醛濃度與的關(guān)系見圖2-2。圖2-2丙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液3.3.5甘油脫水酶（GDHt）的測定甘油脫水酶（GDHt）活性的測定采用Toraya建立的MBTH方法，且根據(jù)酶的反應(yīng)特征做了部分修訂。反應(yīng)原理如下：樣品預(yù)處理：取一定體積菌液離心處理，沉淀用50mmol/L的緩沖液(pH8.0)充分洗滌后離心，倒掉上清液，用緩沖液重懸沉淀，超聲破碎（3s×3s×90次）后離心，上清液即為粗酶液，所有離心條件均為10000r/min,3min,4℃。反應(yīng)體系3.5ml，其中含有0.1mlKCl(0.05mol/L))，0.1ml1,2-丙二醇(0.2mol/L)，0.1ml輔酶B12(15μmol/L)，0.7ml酶液(空白樣品加0.7ml緩沖液)；加入酶液開始計時，40℃反應(yīng)10min后加入1ml0.1mol/L的檸檬酸鉀中止反應(yīng)，加入0.5ml0.1%MBTH顯色15min，再加入1ml蒸餾水稀釋在305nm波長下測定其吸光度。酶活定義：一個酶活單位定義為在上述條件下催化形成1μmol丙醛所需的酶量，比酶活為每毫克蛋白的酶活。相對酶活為酶活與最大酶活的比值，用百分?jǐn)?shù)表示。3.4原料甘油的選擇采用純甘油、粗發(fā)酵甘油、低純度皂化甘油進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗,以確定不同原料對菌體生長和產(chǎn)物1,3-丙二醇生成的影響程度。菌體生長情況可由OD值反映,通過搖瓶發(fā)酵實驗，并測定生物量，根據(jù)測定的數(shù)值就可以分析這三種甘油的發(fā)酵效果。3.5克雷伯氏菌發(fā)酵特性的研究3.5.1溫度對菌體生長和1,3-PD合成的影響在目前報道的1,3-PD合成微生物中，Clostridiumpasteurianum的最適發(fā)酵溫度為30℃，Clostridiumbutyricum的為35℃，而的最適生長和發(fā)酵溫度均介于30℃到37℃之間。因此，設(shè)置28℃-45℃克雷伯氏菌的溫度梯度厭氧發(fā)酵12小時后檢測菌體生物量、甘油轉(zhuǎn)化率和1,3-PD產(chǎn)量與生產(chǎn)強度,然后根據(jù)測定數(shù)值就可以得出克雷伯氏菌發(fā)酵的最佳溫度。3.5.2pH對菌體生長和1,3-PD合成的影響微生物生長過程中機體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)反應(yīng)是酶促反應(yīng)，pH通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性、物質(zhì)的溶解性等方面影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長和代謝。在甘油厭氧代謝過程中，微生物會產(chǎn)生一定的乳酸、乙酸、丁酸等副產(chǎn)物使培養(yǎng)基pH降低，利用磷酸鉀緩沖溶液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值，40℃發(fā)酵12小時，考察pH值變化對菌體生長與產(chǎn)物的合成的影響，從而確定最佳的發(fā)酵PH。同時，實際生產(chǎn)中要不斷地補充緩沖液調(diào)節(jié)體系的PH值，使其保持在最佳的條件下進(jìn)行。3.5.3甘油初始濃度對菌的生長和1,3-PD合成的影響甘油作為發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD的底物是微生物生長、產(chǎn)物合成和副產(chǎn)物形成等的反應(yīng)物，其初始濃度的大小對1,3-PD的合成有很大影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別選擇甘油為10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的濃度梯度，考察甘油濃度對克雷伯氏菌的生長和1,3-PD合成的影響。3.5.4氮源對菌體生長和1,3-PD合成的影響常見有機氮源中酵母浸粉最有利于克雷伯氏菌的生長代謝，而無機氮源對其生長和發(fā)酵結(jié)果有較大影響。故選擇含氮量分別為0.045mol/l的無機氮源研究克雷伯氏菌對不同氮源的利用情況。在培養(yǎng)基初始pH為8.0，發(fā)酵溫度為40℃，20g/L的甘油下培養(yǎng)12小時后，菌體生物量和產(chǎn)物1,3-PD的積累。4結(jié)論根據(jù)實驗結(jié)果，分析不同原料對克雷伯氏菌的生長和產(chǎn)物的合成影響，得到最佳的合成原料。同時分析溫度、PH、甘油濃度、氮源對克雷伯氏菌的生長和產(chǎn)物的合成影響，確定最佳的生產(chǎn)工藝。參考文獻(xiàn)：[1]饒興鶴.全球丙二醇生產(chǎn)現(xiàn)狀及其需求前景.中國石油和化工經(jīng)濟分析,2006,15:52-53[2]陶氏用可再生原料生產(chǎn)丙二醇.中國工業(yè)生物信息網(wǎng)，每周快報（第十八期）./info/view/4866.2007[3]ShellChemicalCompany.Acutetoxicity,skinandeyeirritation,andskinsensitizingpotentialoftrimethyleneglycol.Inproprietaryreport:Toxicologyofthechemicals.Sittingbourne,Kent,UnitedKingdom,1977[4]GingellR.,Kirkpatrick.J.B.,andSteup.D.R.SubchronicToxicityStudyof1,3-propanediolAdministeredOrallytoRats.Inter.J.Toxicol.,2000,19:27-32[5]張燦，張惠斌，黃海燕等.非氨酯中間體2-苯基-1，3-丙二醇的合成.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996,10:468[6]王劍鋒，劉海軍，修志龍，范圣第.生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究進(jìn)展.化學(xué)通報,2001,10:621-625[7]Toraya,T.,S.Kuno,S.Fukui,DistributionofcoenzymeB12-dependentdioldehydrataseandglyceroldehy