模塊四逆境脅迫對植物生理生化指標的

逆境脅迫對植物生理生化指標的影響李忠光，2011.5.25模塊四

綜合性實驗目的掌握逆境脅迫下一些植物生理指標的測定方法；了解逆境脅迫下植物生理生化指標的變化以及逆境傷害和適應的原因。流程圖根據(jù)生物膜透性根據(jù)呼吸作用染料法紙上熒光法：種皮的透性，十字花科5%紅墨水染色法0.1%靛藍、曙紅等染色法TTC法:作為H受體BTB法：外界pH的變化I2-KI染色法：松、衫科種子實驗原理I實驗原理I實驗原理ITTCMethodDyeMethod實驗原理II4260nm實驗原理III實驗原理IV實驗原理V實驗原理VIPODPPO實驗原理VII對硫二硝基苯酸實驗原理VIIICitedfromPlantPhysiology,2003,131:697-706實驗方法I種子發(fā)芽率的測定：各取50粒吸脹的玉米種子或小麥種子→沿胚的中心線切成兩半（嚴格區(qū)分兩個半粒），進行下列實驗：

其中50個半粒進行TTC染色（30℃水浴20min）

另50個半粒進行曙紅染色（室溫染色10min）→洗凈后觀察根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計算發(fā)芽率。品種為晴3或魯玉13的玉米種子或小麥種子（購于西山種子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸餾水漂洗干凈→用蒸餾水于26℃下吸漲12h→播于墊有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌發(fā)60h→計算發(fā)芽率（注意與前面結果比較）→選取長勢一致的玉米幼苗做干旱5天、高溫、鹽漬或低溫下處理（去除較矮或較高的玉米幼苗）。實驗方法I呼吸作用的測定：材料的準備：將預測量的材料稱重后（0.5g）放入測量瓶。測定方法：打開電源預熱5min→打開氣泵開關→打開閉路開關→用堿石灰管分別連接面板上的“OUT”和“IN”，主機的“OUT1”和“IN1”分別與測量瓶的“OUT1”和“IN1”相連→立即開始記時→測量1min的CO2增加量計算：每分鐘每克材料的CO2釋放量（mL.g-1.min-1）。實驗方法IIPro的提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組的幼苗→加入3mL3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測定：上清液各2mL→分別加入(2mL冰乙酸和2mL茚三酮試劑)→煮沸15min→冷卻后→5000rpm離心10min（若沒沉淀可略此步驟）→分別測定A520計算：Procontent=

(mmol.g-1FW)實驗方法IIIMDA提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組→加入3mL0.1%TCA和少許石英砂→充分研磨→用2mL0.1%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測定：分別取上清液各1mL→加入0.6%TBA（用10%TCA配制）3mL→煮沸15min→冷卻后→5000rpm離心5min（視沉淀有無）→分別測定OD450和OD532計算：實驗方法IVH2O2提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組→加入3mL

0.3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mLTCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測定：分別取上清液各4mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]0.2mL→搖勻→OD410計算：H2O2content=

(mmol.g-1FW)實驗方法V實驗方法VI1、抗氧化酶的提?。悍謩e取0.1g實驗材料→加入少許石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,內含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→轉入離心管中→用2ml提取液洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積→用于測定POD和PPO酶活性或分裝后轉至-20或-80℃保存。

2、POD測定：取POD反應混合液（10

mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應2min時的A470。3、PPO測定：取PPO反應混合液（20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應

2min時的A410。

以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則：實驗方法VIPODactivities=

(mmol.g-1FWmin-1)PPOactivities=

(U.g-1FW)4、計算實驗方法VI實驗方法VIIGSH的提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測定：上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)→分別加入2mL0.1MPBS(pH=7.7)→1mL2mMDTNB→25℃5min→測定A412計算：GSHcontent=

(mmol.g-1FW)實驗方法VIIIASA的提?。悍謩e取0.1g實驗組和對照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測定：上清液各0.8mL(空白用5%TCA代替)→分別加入0.8mL0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸餾水→搖勻→分別加入0.8mL5%TCA、44%磷酸和4%聯(lián)吡啶→搖勻→加入3%FeCl30.8mL→37℃15min→測定A525計算：ASAcontent=

(mmol.g-1FW)模塊實驗報告“以逆境脅迫