核磁共振波譜分析-9

二維核磁共振譜1971年Jeener首先提出2D-NMR思想：具有兩個(gè)時(shí)間變量的NMR；1976年Ernst小組成功實(shí)現(xiàn)了2D-NMR實(shí)驗(yàn)后，確定了二維核磁共振的理論基礎(chǔ)；20世紀(jì)80年代：2D-NMR加速發(fā)展；用途：解析復(fù)雜有機(jī)分子最有力的工具；溶液中分子的三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定；分子動(dòng)態(tài)過程的研究；多維NMR技術(shù)：研究生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸等）最有效的方法。概述NMR一維譜的信號(hào)是一個(gè)頻率的函數(shù)，共振峰分布在一個(gè)頻率軸(或磁場(chǎng))上，可記為S(ω)。而二維譜信號(hào)是兩個(gè)獨(dú)立頻率變量的函數(shù)，記為S(ω1,ω2)，共振信號(hào)分布在兩個(gè)頻率軸組成的平面上。也就是說2DNMR將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等NMR參數(shù)在二維平面上展開，于是在一般一維譜中重迭在一個(gè)坐標(biāo)軸上的信號(hào)，被分散到由兩個(gè)獨(dú)立的頻率軸構(gòu)成的平面上，使得圖譜解析和尋找核之間的相互作用更為容易。不同的二維NMR方法得到的圖譜不同，兩個(gè)坐標(biāo)軸所代表的參數(shù)也不同。概述減少了譜線的擁擠和重疊，提高了核之間相互關(guān)系的新信息，因而增加了結(jié)構(gòu)信息，有利于復(fù)雜譜圖的解析。1D2D2D譜比1D譜譜峰分辨能力更強(qiáng)可在兩維巧妙地設(shè)計(jì)某些物理量以考察它們的相關(guān)性或連接關(guān)系2signalsoverlapped2crosspeaksresolved位移相關(guān)譜二維實(shí)驗(yàn)的脈沖序列預(yù)備期：使自旋體系恢復(fù)Boltzmann分布，而處于初始熱平衡狀態(tài)。理論上應(yīng)取D1≥5T1（T1為縱向弛豫時(shí)間），但為節(jié)省時(shí)間，實(shí)驗(yàn)中一般取D1=(2～3)T1。發(fā)展期：在預(yù)備期末，施加一個(gè)或多個(gè)90脈沖，使系統(tǒng)建立共振非平衡狀態(tài)。演化時(shí)間t1是以某固定增量t1為單位，逐步延遲t1。每增加一個(gè)t1，其對(duì)應(yīng)的核磁信號(hào)的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延遲增量t1可得到二維實(shí)驗(yàn)中的另一維信號(hào)，即F1域的時(shí)間函數(shù)。混合期：由一組固定長(zhǎng)度的脈沖和延遲組成。在混合期自旋核間通過相干轉(zhuǎn)移，使t1期間存在的信息直接影響檢測(cè)期信號(hào)的相位和幅值。根據(jù)二維實(shí)驗(yàn)所提供的信息不同，也可以不設(shè)混合期。檢測(cè)期：在檢測(cè)期期間采集的FID信號(hào)是F2域的時(shí)間函數(shù)，所對(duì)應(yīng)的軸通常是一維核磁共振譜中的頻率軸，即表示化學(xué)位移的軸。但檢測(cè)期期間采集的FID信號(hào)都是發(fā)展期的函數(shù)，核進(jìn)動(dòng)的磁化矢量具有不同的化學(xué)位移和自旋偶合常數(shù)，其FID信號(hào)是這些因素的相位調(diào)制的結(jié)果。因此，通過控制時(shí)間長(zhǎng)度可使某期間僅表現(xiàn)化學(xué)位移的相位調(diào)制，而某期間又僅表現(xiàn)自旋耦合的相位調(diào)制，通過施加不同的調(diào)制就產(chǎn)生了各種不同的二維核磁共振譜。相干轉(zhuǎn)移譜和極化轉(zhuǎn)移譜基于耦合的相關(guān)轉(zhuǎn)移譜：核自旋間的J耦合（通過原子核間化學(xué)鍵電子的間接作用而發(fā)生的耦合，又稱間接耦合），與橫向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系基于動(dòng)力學(xué)過程的極化轉(zhuǎn)移譜：D耦合（不需要經(jīng)過介質(zhì)的空間相互作用，又稱直接耦合或偶極偶極耦合），與縱向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系二維譜的表現(xiàn)方式

堆積圖

Stackedtraceplot

等高線圖(平面等值線圖)

Contourplot

截面圖

Section

投影圖

Projection堆積圖堆積圖含有全部的強(qiáng)度信息，同時(shí)由于它的直觀性，很易引人注目。但是，堆積圖有某些缺點(diǎn)：由于透視圖的扭曲難于進(jìn)行解釋；如果大信號(hào)之后存在小信號(hào)，則由于大信號(hào)峰的掩蓋，致使小信號(hào)峰測(cè)不出來。必要的時(shí)候需要從不同角度進(jìn)行透視。畫堆積圖很費(fèi)時(shí)間，可能要一小時(shí)或更長(zhǎng)。等高線圖等高線圖為把堆積圖用平行于F1和F2域的平面進(jìn)行平切后所得。等高線圖中最中心的圓圈表示峰的位置，圓圈的數(shù)目表示峰的強(qiáng)度。強(qiáng)度信息部分損失。保存強(qiáng)度信息量的多少，取決于平切面的最低線和平切的次數(shù)。如果最低線太低，將出線許多噪音信號(hào)，干擾真實(shí)信號(hào)；如太高，一些小的真正信號(hào)易被忽略。等高線圖很容易鑒定，而且不像堆積圖那些隱藏信號(hào)，另外不存在透視圖的扭曲，測(cè)試時(shí)間也較短，幾分鐘便能完成畫圖。堆積圖等高線圖CHCl3的H-HCOSY譜投影圖投影圖是1D譜形式，相當(dāng)于寬帶質(zhì)子去偶?xì)渥V，可準(zhǔn)確確定各譜峰的化學(xué)位移值。投影圖截面圖從2D圖中取出某一個(gè)譜峰（F1或F2）所對(duì)應(yīng)相關(guān)峰的1D斷面圖，對(duì)檢測(cè)一些弱小的相關(guān)峰很有用。截面圖二維譜峰的命名交叉峰或相關(guān)峰(crosspeak)：出現(xiàn)在ω1≠ω2(即非對(duì)角線上)處。從峰的位置關(guān)系可以判斷哪些峰之間有偶合關(guān)系，從而得到哪些核之間有偶合關(guān)系，交叉峰是二維譜中最有用的部分。對(duì)角峰(diagonalpeak)或自相關(guān)峰(Autopeak)：位于對(duì)角線(ω1＝ω2)上的峰，稱為對(duì)角峰。對(duì)角峰在F1或F2軸的投影得到常規(guī)的偶合譜或去偶譜。交叉峰或相關(guān)峰對(duì)角峰或自相關(guān)峰交叉峰或相關(guān)峰對(duì)角峰或自相關(guān)峰二維譜的分類J分解譜

JResolvedSpectroscopy,d-J譜同核(homonuclear),異核(heteronuclear)化學(xué)位移相關(guān)譜

ChemicalShiftCorrelationSpectroscopy,d-d譜同核偶合,異核偶合,NOE和化學(xué)交換多量子譜

MultipleQuantumSpectroscopyJ分解譜一維譜中譜峰往往嚴(yán)重重疊，造成譜線裂分不能清楚分辨，耦合常數(shù)不易讀出。二維J分解譜是將不同的NMR信號(hào)分解在兩個(gè)不同的軸上，使重疊在一起的一維譜的化學(xué)位移δ和偶合常數(shù)J分解在平面兩個(gè)坐標(biāo)上，便于解析。在二維J分解譜中，只要化學(xué)位移略有差別，峰組的重疊就有可能避免，從而解決一維譜譜峰重疊的問題。1.同核J分解譜同核J分解譜AX體系1.同核J分解譜同核J分解譜所用脈沖序列18090t1/2t1/2譜信息:(弱偶合體系)Δν/J≥10時(shí)為弱偶合，一級(jí)圖譜。

w2:全去偶譜→化學(xué)位移dH，轉(zhuǎn)動(dòng)前化學(xué)位移與耦合常數(shù)同時(shí)出現(xiàn)。w1:譜線多重性→偶合常數(shù)JHH，峰組的峰數(shù)一目了然。若為強(qiáng)偶合體系，其同核J譜的表現(xiàn)形式將比較復(fù)雜。1.同核J分解譜AX體系J譜AX21JAX21JAX2體系J譜同核J分解譜AX3體系J譜A2X3體系J譜δ(f2)J(f1)0HzδJ0Hz2DJ譜在F2維的投影為完全去偶?xì)渥V。2.異核J分解譜譜信息:w2:全去偶譜

→化學(xué)位移dCw1:譜線裂分

→偶合常數(shù)JCH（直接相連的氫原子耦合裂分產(chǎn)生）

異核二維J分解譜中被測(cè)定的核的化學(xué)位移為一維，該種核與另一種核之間偶合的多重峰裂分為另一維。2DC-HJ分解譜

由于使用的脈沖序列不同，可以得到幾種圖譜。應(yīng)用最多的為門控去偶異核13C-1HJ分解2DNMR。此時(shí)F2軸為13C的化學(xué)位移δC，F(xiàn)1軸為JCH偶合的多重峰。

出峰情況是CH為二重峰，CH2為三重峰，CH3為四重峰，季碳單峰或不出峰。由于DEPT等測(cè)定碳原子級(jí)數(shù)的方法能代替異核J譜，且檢測(cè)速度快，操作方便，因此異核J譜較少應(yīng)用?；瘜W(xué)位移相關(guān)譜同核化學(xué)位移相關(guān)譜1)通過化學(xué)鍵：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE2）通過空間：NOESY,ROESY異核化學(xué)位移相關(guān)譜1)強(qiáng)調(diào)大的偶合常數(shù)：HMQC(1H-13C–COSY)2)強(qiáng)調(diào)小的偶合常數(shù)，壓制大的偶合常數(shù)：COLOC(HMBC)(遠(yuǎn)程1H-13C–COSY)

含有兩個(gè)頻率軸和一個(gè)強(qiáng)度軸提供相互偶合的觀察核之間的相關(guān)關(guān)系信息對(duì)復(fù)雜分子（如生物分子）的結(jié)構(gòu)確定以及分子與分子之間相互作用的研究非常有用?？闪私馍锓肿釉谌芤籂顟B(tài)時(shí)的空間結(jié)構(gòu)（X-單晶衍射無(wú)法做到）化學(xué)位移相關(guān)譜1.1H-1HCOSY最常用的位移相關(guān)譜，簡(jiǎn)化多重峰，直觀地給出耦合關(guān)系。

相當(dāng)于做一系列連續(xù)選擇性去耦實(shí)驗(yàn)去求得耦合關(guān)系，用以確定質(zhì)子之間的連接順序，可提供全部1H-1H之間的關(guān)聯(lián)。因此1H-1HCOSY是歸屬譜線，推導(dǎo)結(jié)構(gòu)及確定結(jié)構(gòu)的有力工具。兩組對(duì)角峰和交叉峰可以組成一個(gè)正方形，并且由此來推測(cè)這兩組核A(δA,δA)和X(δX,δX)有偶合關(guān)系。同核化學(xué)位移相關(guān)譜

(HomonuclearCorrelationofchemicalshift)解譜方法：以任一交叉峰為出發(fā)點(diǎn)，可以確定相應(yīng)的2組峰組的耦合關(guān)系而不必考慮氫譜中的裂分峰形。交叉峰是沿對(duì)角線對(duì)稱分布的，因而只分析對(duì)角線一側(cè)的交叉峰即可。一般反應(yīng)3J耦合關(guān)系，遠(yuǎn)程耦合較弱，不產(chǎn)生交叉峰。當(dāng)3J較小時(shí)（如兩面角接近90o）也可能無(wú)交叉峰。1H-1HCOSYF1和F2皆為化學(xué)位移。兩組對(duì)角峰為對(duì)角線與兩組交叉峰組成正方形，說明這兩組質(zhì)子有偶合。2,3-二溴丙酸的碳上3個(gè)質(zhì)子為AMX系統(tǒng)。

2,3-二溴丙酸的AMX體系1H-1HCOSYC=C-O-CH2-CH2-CH2-CH3HHH1234567

12345674756231COSY-90o的基本脈沖序列包括兩個(gè)基本脈沖在此脈沖作用下，根據(jù)發(fā)展期t1的不同，自旋體系的各個(gè)不同的躍遷之間產(chǎn)生磁化傳遞，通過同核偶合建立同種核共振頻率間連接圖。此圖的二個(gè)軸都是1H的δ，在ω1＝ω2的對(duì)角線上可以找出一維1H譜相對(duì)應(yīng)譜峰信號(hào)。通過交叉峰分別作垂線及水平線與對(duì)角線相交，即可以找到相應(yīng)偶合的氫核。因此從一張同核位移相關(guān)譜可找出所有偶合體系，即等于一整套雙照射實(shí)驗(yàn)的譜圖。

COSY-90o

COSYof2－丁烯酸乙酯COSY-45o基本脈沖：90o-t1-45o-ACQ.

在COSY-90的基礎(chǔ)上，將第二脈沖改變成45o，許多的天然產(chǎn)物的直接連接躍遷譜峰在對(duì)角線附近，導(dǎo)致譜線相互重疊，不易解析。采用COSY-45o由于大大限制了多重峰內(nèi)間接躍遷，重點(diǎn)反映多重峰間的直接躍遷，減少了平行躍遷間的磁化轉(zhuǎn)移強(qiáng)度，即消除了對(duì)角線附近的交叉峰，使對(duì)角線附近清晰，有利于發(fā)現(xiàn)強(qiáng)耦合體系之間的相關(guān)峰。從COSY-45可判別耦合常數(shù)的符號(hào)。化合物A的COSY45o譜，對(duì)角線峰顯著簡(jiǎn)化，譜峰清晰。由交叉峰所顯示的傾斜度識(shí)別出只有1、2位存在同碳?xì)漶詈?，其余為鄰碳?xì)漶詈?。COSY-90COSY-45譜中任意一個(gè)交叉峰含兩個(gè)緊靠的矩形（它們共同形成一個(gè)交叉峰），通過稍下的矩形中心往稍上的矩形中心連線，可得到一傾斜的箭頭。箭頭指向左上為正，箭頭指向右上為負(fù)。2，3-二溴丙酸通常通過偶數(shù)鍵偶合的偶合常數(shù)J為負(fù)值，通過奇數(shù)鍵偶合的偶合常數(shù)J為正值。X

M

A2.總相關(guān)譜

（TOtalCorrelationSpectroscopY,TOCSY）是一種旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系實(shí)驗(yàn)（自旋鎖定實(shí)驗(yàn)），自旋鎖定是把COSY序列中的第二脈沖以及NOESY序列中最后兩個(gè)脈沖（包括混合時(shí)間），用一個(gè)長(zhǎng)射頻脈沖取代，把自旋沿著旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系的一個(gè)鎖定，在這種情況下不存在化學(xué)位移差，通過發(fā)生標(biāo)量偶合的磁化轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了全部相關(guān)。TOCSY也有稱之為HOHAHA?？梢蕴峁┳孕到y(tǒng)中偶合關(guān)聯(lián)信息。TOCSY把COSY的作用延伸，從任一氫的峰組可以找到與該氫核在同一耦合體系的所有氫核的相關(guān)峰。TOCSY的外型與COSY相似，但交叉峰的數(shù)目大大增加。TOCSY質(zhì)子a,b,candd構(gòu)成自旋體系既一個(gè)偶合網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),CH3CH2構(gòu)成另外一個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這是兩個(gè)獨(dú)立的自旋體系

，COSY譜中，a與b相關(guān)而在TOCSY譜中，它不僅顯示與質(zhì)子b相關(guān)，而且也與兩個(gè)（CH2）candd相關(guān)。

3.天然豐度的雙量子13C譜

INADEQUATE(13C-13CCOSY)2D-INADEQUATE(IncredibleNaturalAboundanceDoublE

QUAntumTransferExperiment）直接測(cè)定13C-13C之間的連接關(guān)系，在質(zhì)子去偶的13C譜中，除了13C信號(hào)外，還有比它弱200倍的13C-13C偶合衛(wèi)星峰，13C-13C偶合含有豐富的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的信息。由于碳是組成分子骨架，它更能直接反映化學(xué)鍵的特征與取代情況。橫軸為13C化學(xué)位移，縱軸為雙量子相干頻率，相互偶合的兩個(gè)碳原子作為一對(duì)雙峰排列在同一水平線上。但是由于13C天然豐度僅僅為1.1%，出現(xiàn)13C-13C偶合的幾率為0.01％，13C-13C偶合引起的衛(wèi)線通常離13C強(qiáng)峰只有20Hz左右，其強(qiáng)度又僅僅是13C強(qiáng)峰的1/200，這種弱峰往往出現(xiàn)在強(qiáng)13C峰的腋部，加上旋轉(zhuǎn)邊帶，質(zhì)子去偶不完全，微量雜質(zhì)的影響等因素，使1JC-C測(cè)試非常困難。利用雙量子躍遷的相位特性可以壓住強(qiáng)線，突出衛(wèi)線求出JC-C,并根據(jù)Jc-c確定其相鄰的碳。13C-13CCOSY它只有一個(gè)雙量子躍遷，其頻率正比于兩個(gè)偶合的13C核的化學(xué)位移之和的平均值。所以如果兩個(gè)碳具有相同的雙量子躍遷頻率，即可以判斷，它們是相鄰。在INADEQUATE譜圖中F1與F2分別代表雙量子躍遷頻率和13C的衛(wèi)線，依次代表雙量子和單量子躍遷頻率。譜圖中一個(gè)軸是13C的化學(xué)位移，一個(gè)為雙量子躍遷頻率，其頻率正比于兩個(gè)偶合的13C核的化學(xué)位移之和的平均值。因此譜圖中F1=2F2的斜線兩側(cè)對(duì)稱分布著兩個(gè)相連的13C原子信號(hào)，表示碳偶合對(duì)的單量子平均頻率與雙量子頻率間的關(guān)系，水平連線表明一對(duì)偶合碳具有相同的雙量子躍遷頻率，可以判斷它們是直接相連的碳。依此類推可以找出化合物中所有13C原子連接順序。2DINADEQUATE譜所用脈沖序列180y90x90x13C:90φΔΔ[ψ]t12DINADEQUATE的2種形式F2域?yàn)榛瘜W(xué)位移，F(xiàn)1域?yàn)殡p量子躍遷頻率，相互耦合的2個(gè)碳原子作為一對(duì)雙峰排列在平行于F2域的同一水平線上。一對(duì)耦合的碳（相當(dāng)于AX體系）具有相同的雙量子躍遷頻率，用水平連線示出，如：C1-C2,C2-C3,C3-C4。由于雙量子頻率為偶合的一對(duì)13C－13C的單量子頻率之和，連線的中心落在F1=2F2的準(zhǔn)對(duì)角線上。2143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567譜信息：F2

是碳譜，單量子頻率F1是雙量子頻率，為偶

合的一對(duì)13C－13C的單量子頻率之和一對(duì)13C－13C處于水平線上，左右對(duì)稱地處于準(zhǔn)對(duì)角線（F1=2F2)兩側(cè)。F2域和F1域均為13C化學(xué)位移，類似于H-HCOSY譜，相互耦合的2個(gè)碳原子作為一對(duì)雙峰出現(xiàn)在對(duì)角線兩側(cè)對(duì)稱的位置上。2DINADEQUATE的2種形式4.NOESY(NuclearOverhauserEffectSpectroscopY)NOESY反映了有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中核與核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學(xué)鍵無(wú)關(guān)。因此對(duì)確定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)等）有著重要意義。NOESYNOESY的譜圖與1H-1HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對(duì)角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個(gè)氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個(gè)氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實(shí)驗(yàn)是由COSY實(shí)驗(yàn)發(fā)展而來為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時(shí)需對(duì)照它的1H-1HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除。在相敏NOESY譜圖中交叉峰有正峰和負(fù)峰，分別表示正的NOE和負(fù)的NOE。NOESYNOESY譜所用的脈沖序列909090t1tm“inversion”NOESYNOESYHbHaHcCHbHaHcδ(f2)δ(f1)COSYOFPBFNOESYofPBFCOSY當(dāng)遇到中等大小的分子時(shí)（分子量約為1000-3000），由于此時(shí)NOE的