核磁共振波譜分析-9

二維核磁共振譜1971年Jeener首先提出2D-NMR思想：具有兩個時間變量的NMR；1976年Ernst小組成功實現(xiàn)了2D-NMR實驗后，確定了二維核磁共振的理論基礎(chǔ)；20世紀80年代：2D-NMR加速發(fā)展；用途：解析復雜有機分子最有力的工具；溶液中分子的三維空間結(jié)構(gòu)的測定；分子動態(tài)過程的研究；多維NMR技術(shù)：研究生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸等）最有效的方法。概述NMR一維譜的信號是一個頻率的函數(shù)，共振峰分布在一個頻率軸(或磁場)上，可記為S(ω)。而二維譜信號是兩個獨立頻率變量的函數(shù)，記為S(ω1,ω2)，共振信號分布在兩個頻率軸組成的平面上。也就是說2DNMR將化學位移、偶合常數(shù)等NMR參數(shù)在二維平面上展開，于是在一般一維譜中重迭在一個坐標軸上的信號，被分散到由兩個獨立的頻率軸構(gòu)成的平面上，使得圖譜解析和尋找核之間的相互作用更為容易。不同的二維NMR方法得到的圖譜不同，兩個坐標軸所代表的參數(shù)也不同。概述減少了譜線的擁擠和重疊，提高了核之間相互關(guān)系的新信息，因而增加了結(jié)構(gòu)信息，有利于復雜譜圖的解析。1D2D2D譜比1D譜譜峰分辨能力更強可在兩維巧妙地設(shè)計某些物理量以考察它們的相關(guān)性或連接關(guān)系2signalsoverlapped2crosspeaksresolved位移相關(guān)譜二維實驗的脈沖序列預備期：使自旋體系恢復Boltzmann分布，而處于初始熱平衡狀態(tài)。理論上應(yīng)取D1≥5T1（T1為縱向弛豫時間），但為節(jié)省時間，實驗中一般取D1=(2～3)T1。發(fā)展期：在預備期末，施加一個或多個90脈沖，使系統(tǒng)建立共振非平衡狀態(tài)。演化時間t1是以某固定增量t1為單位，逐步延遲t1。每增加一個t1，其對應(yīng)的核磁信號的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延遲增量t1可得到二維實驗中的另一維信號，即F1域的時間函數(shù)?；旌掀冢河梢唤M固定長度的脈沖和延遲組成。在混合期自旋核間通過相干轉(zhuǎn)移，使t1期間存在的信息直接影響檢測期信號的相位和幅值。根據(jù)二維實驗所提供的信息不同，也可以不設(shè)混合期。檢測期：在檢測期期間采集的FID信號是F2域的時間函數(shù)，所對應(yīng)的軸通常是一維核磁共振譜中的頻率軸，即表示化學位移的軸。但檢測期期間采集的FID信號都是發(fā)展期的函數(shù)，核進動的磁化矢量具有不同的化學位移和自旋偶合常數(shù)，其FID信號是這些因素的相位調(diào)制的結(jié)果。因此，通過控制時間長度可使某期間僅表現(xiàn)化學位移的相位調(diào)制，而某期間又僅表現(xiàn)自旋耦合的相位調(diào)制，通過施加不同的調(diào)制就產(chǎn)生了各種不同的二維核磁共振譜。相干轉(zhuǎn)移譜和極化轉(zhuǎn)移譜基于耦合的相關(guān)轉(zhuǎn)移譜：核自旋間的J耦合（通過原子核間化學鍵電子的間接作用而發(fā)生的耦合，又稱間接耦合），與橫向磁化強度相聯(lián)系基于動力學過程的極化轉(zhuǎn)移譜：D耦合（不需要經(jīng)過介質(zhì)的空間相互作用，又稱直接耦合或偶極偶極耦合），與縱向磁化強度相聯(lián)系二維譜的表現(xiàn)方式

堆積圖

Stackedtraceplot

等高線圖(平面等值線圖)

Contourplot

截面圖

Section

投影圖

Projection堆積圖堆積圖含有全部的強度信息，同時由于它的直觀性，很易引人注目。但是，堆積圖有某些缺點：由于透視圖的扭曲難于進行解釋；如果大信號之后存在小信號，則由于大信號峰的掩蓋，致使小信號峰測不出來。必要的時候需要從不同角度進行透視。畫堆積圖很費時間，可能要一小時或更長。等高線圖等高線圖為把堆積圖用平行于F1和F2域的平面進行平切后所得。等高線圖中最中心的圓圈表示峰的位置，圓圈的數(shù)目表示峰的強度。強度信息部分損失。保存強度信息量的多少，取決于平切面的最低線和平切的次數(shù)。如果最低線太低，將出線許多噪音信號，干擾真實信號；如太高，一些小的真正信號易被忽略。等高線圖很容易鑒定，而且不像堆積圖那些隱藏信號，另外不存在透視圖的扭曲，測試時間也較短，幾分鐘便能完成畫圖。堆積圖等高線圖CHCl3的H-HCOSY譜投影圖投影圖是1D譜形式，相當于寬帶質(zhì)子去偶氫譜，可準確確定各譜峰的化學位移值。投影圖截面圖從2D圖中取出某一個譜峰（F1或F2）所對應(yīng)相關(guān)峰的1D斷面圖，對檢測一些弱小的相關(guān)峰很有用。截面圖二維譜峰的命名交叉峰或相關(guān)峰(crosspeak)：出現(xiàn)在ω1≠ω2(即非對角線上)處。從峰的位置關(guān)系可以判斷哪些峰之間有偶合關(guān)系，從而得到哪些核之間有偶合關(guān)系，交叉峰是二維譜中最有用的部分。對角峰(diagonalpeak)或自相關(guān)峰(Autopeak)：位于對角線(ω1＝ω2)上的峰，稱為對角峰。對角峰在F1或F2軸的投影得到常規(guī)的偶合譜或去偶譜。交叉峰或相關(guān)峰對角峰或自相關(guān)峰交叉峰或相關(guān)峰對角峰或自相關(guān)峰二維譜的分類J分解譜

JResolvedSpectroscopy,d-J譜同核(homonuclear),異核(heteronuclear)化學位移相關(guān)譜

ChemicalShiftCorrelationSpectroscopy,d-d譜同核偶合,異核偶合,NOE和化學交換多量子譜

MultipleQuantumSpectroscopyJ分解譜一維譜中譜峰往往嚴重重疊，造成譜線裂分不能清楚分辨，耦合常數(shù)不易讀出。二維J分解譜是將不同的NMR信號分解在兩個不同的軸上，使重疊在一起的一維譜的化學位移δ和偶合常數(shù)J分解在平面兩個坐標上，便于解析。在二維J分解譜中，只要化學位移略有差別，峰組的重疊就有可能避免，從而解決一維譜譜峰重疊的問題。1.同核J分解譜同核J分解譜AX體系1.同核J分解譜同核J分解譜所用脈沖序列18090t1/2t1/2譜信息:(弱偶合體系)Δν/J≥10時為弱偶合，一級圖譜。

w2:全去偶譜→化學位移dH，轉(zhuǎn)動前化學位移與耦合常數(shù)同時出現(xiàn)。w1:譜線多重性→偶合常數(shù)JHH，峰組的峰數(shù)一目了然。若為強偶合體系，其同核J譜的表現(xiàn)形式將比較復雜。1.同核J分解譜AX體系J譜AX21JAX21JAX2體系J譜同核J分解譜AX3體系J譜A2X3體系J譜δ(f2)J(f1)0HzδJ0Hz2DJ譜在F2維的投影為完全去偶氫譜。2.異核J分解譜譜信息:w2:全去偶譜

→化學位移dCw1:譜線裂分

→偶合常數(shù)JCH（直接相連的氫原子耦合裂分產(chǎn)生）

異核二維J分解譜中被測定的核的化學位移為一維，該種核與另一種核之間偶合的多重峰裂分為另一維。2DC-HJ分解譜

由于使用的脈沖序列不同，可以得到幾種圖譜。應(yīng)用最多的為門控去偶異核13C-1HJ分解2DNMR。此時F2軸為13C的化學位移δC，F(xiàn)1軸為JCH偶合的多重峰。

出峰情況是CH為二重峰，CH2為三重峰，CH3為四重峰，季碳單峰或不出峰。由于DEPT等測定碳原子級數(shù)的方法能代替異核J譜，且檢測速度快，操作方便，因此異核J譜較少應(yīng)用?；瘜W位移相關(guān)譜同核化學位移相關(guān)譜1)通過化學鍵：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE2）通過空間：NOESY,ROESY異核化學位移相關(guān)譜1)強調(diào)大的偶合常數(shù)：HMQC(1H-13C–COSY)2)強調(diào)小的偶合常數(shù)，壓制大的偶合常數(shù)：COLOC(HMBC)(遠程1H-13C–COSY)

含有兩個頻率軸和一個強度軸提供相互偶合的觀察核之間的相關(guān)關(guān)系信息對復雜分子（如生物分子）的結(jié)構(gòu)確定以及分子與分子之間相互作用的研究非常有用。可了解生物分子在溶液狀態(tài)時的空間結(jié)構(gòu)（X-單晶衍射無法做到）化學位移相關(guān)譜1.1H-1HCOSY最常用的位移相關(guān)譜，簡化多重峰，直觀地給出耦合關(guān)系。

相當于做一系列連續(xù)選擇性去耦實驗去求得耦合關(guān)系，用以確定質(zhì)子之間的連接順序，可提供全部1H-1H之間的關(guān)聯(lián)。因此1H-1HCOSY是歸屬譜線，推導結(jié)構(gòu)及確定結(jié)構(gòu)的有力工具。兩組對角峰和交叉峰可以組成一個正方形，并且由此來推測這兩組核A(δA,δA)和X(δX,δX)有偶合關(guān)系。同核化學位移相關(guān)譜

(HomonuclearCorrelationofchemicalshift)解譜方法：以任一交叉峰為出發(fā)點，可以確定相應(yīng)的2組峰組的耦合關(guān)系而不必考慮氫譜中的裂分峰形。交叉峰是沿對角線對稱分布的，因而只分析對角線一側(cè)的交叉峰即可。一般反應(yīng)3J耦合關(guān)系，遠程耦合較弱，不產(chǎn)生交叉峰。當3J較小時（如兩面角接近90o）也可能無交叉峰。1H-1HCOSYF1和F2皆為化學位移。兩組對角峰為對角線與兩組交叉峰組成正方形，說明這兩組質(zhì)子有偶合。2,3-二溴丙酸的碳上3個質(zhì)子為AMX系統(tǒng)。

2,3-二溴丙酸的AMX體系1H-1HCOSYC=C-O-CH2-CH2-CH2-CH3HHH1234567

12345674756231COSY-90o的基本脈沖序列包括兩個基本脈沖在此脈沖作用下，根據(jù)發(fā)展期t1的不同，自旋體系的各個不同的躍遷之間產(chǎn)生磁化傳遞，通過同核偶合建立同種核共振頻率間連接圖。此圖的二個軸都是1H的δ，在ω1＝ω2的對角線上可以找出一維1H譜相對應(yīng)譜峰信號。通過交叉峰分別作垂線及水平線與對角線相交，即可以找到相應(yīng)偶合的氫核。因此從一張同核位移相關(guān)譜可找出所有偶合體系，即等于一整套雙照射實驗的譜圖。

COSY-90o

COSYof2－丁烯酸乙酯COSY-45o基本脈沖：90o-t1-45o-ACQ.

在COSY-90的基礎(chǔ)上，將第二脈沖改變成45o，許多的天然產(chǎn)物的直接連接躍遷譜峰在對角線附近，導致譜線相互重疊，不易解析。采用COSY-45o由于大大限制了多重峰內(nèi)間接躍遷，重點反映多重峰間的直接躍遷，減少了平行躍遷間的磁化轉(zhuǎn)移強度，即消除了對角線附近的交叉峰，使對角線附近清晰，有利于發(fā)現(xiàn)強耦合體系之間的相關(guān)峰。從COSY-45可判別耦合常數(shù)的符號?；衔顰的COSY45o譜，對角線峰顯著簡化，譜峰清晰。由交叉峰所顯示的傾斜度識別出只有1、2位存在同碳氫耦合，其余為鄰碳氫耦合。COSY-90COSY-45譜中任意一個交叉峰含兩個緊靠的矩形（它們共同形成一個交叉峰），通過稍下的矩形中心往稍上的矩形中心連線，可得到一傾斜的箭頭。箭頭指向左上為正，箭頭指向右上為負。2，3-二溴丙酸通常通過偶數(shù)鍵偶合的偶合常數(shù)J為負值，通過奇數(shù)鍵偶合的偶合常數(shù)J為正值。X

M

A2.總相關(guān)譜

（TOtalCorrelationSpectroscopY,TOCSY）是一種旋轉(zhuǎn)坐標系實驗（自旋鎖定實驗），自旋鎖定是把COSY序列中的第二脈沖以及NOESY序列中最后兩個脈沖（包括混合時間），用一個長射頻脈沖取代，把自旋沿著旋轉(zhuǎn)坐標系的一個鎖定，在這種情況下不存在化學位移差，通過發(fā)生標量偶合的磁化轉(zhuǎn)移，導致了全部相關(guān)。TOCSY也有稱之為HOHAHA。可以提供自旋系統(tǒng)中偶合關(guān)聯(lián)信息。TOCSY把COSY的作用延伸，從任一氫的峰組可以找到與該氫核在同一耦合體系的所有氫核的相關(guān)峰。TOCSY的外型與COSY相似，但交叉峰的數(shù)目大大增加。TOCSY質(zhì)子a,b,candd構(gòu)成自旋體系既一個偶合網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),CH3CH2構(gòu)成另外一個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這是兩個獨立的自旋體系

，COSY譜中，a與b相關(guān)而在TOCSY譜中，它不僅顯示與質(zhì)子b相關(guān)，而且也與兩個（CH2）candd相關(guān)。

3.天然豐度的雙量子13C譜

INADEQUATE(13C-13CCOSY)2D-INADEQUATE(IncredibleNaturalAboundanceDoublE

QUAntumTransferExperiment）直接測定13C-13C之間的連接關(guān)系，在質(zhì)子去偶的13C譜中，除了13C信號外，還有比它弱200倍的13C-13C偶合衛(wèi)星峰，13C-13C偶合含有豐富的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的信息。由于碳是組成分子骨架，它更能直接反映化學鍵的特征與取代情況。橫軸為13C化學位移，縱軸為雙量子相干頻率，相互偶合的兩個碳原子作為一對雙峰排列在同一水平線上。但是由于13C天然豐度僅僅為1.1%，出現(xiàn)13C-13C偶合的幾率為0.01％，13C-13C偶合引起的衛(wèi)線通常離13C強峰只有20Hz左右，其強度又僅僅是13C強峰的1/200，這種弱峰往往出現(xiàn)在強13C峰的腋部，加上旋轉(zhuǎn)邊帶，質(zhì)子去偶不完全，微量雜質(zhì)的影響等因素，使1JC-C測試非常困難。利用雙量子躍遷的相位特性可以壓住強線，突出衛(wèi)線求出JC-C,并根據(jù)Jc-c確定其相鄰的碳。13C-13CCOSY它只有一個雙量子躍遷，其頻率正比于兩個偶合的13C核的化學位移之和的平均值。所以如果兩個碳具有相同的雙量子躍遷頻率，即可以判斷，它們是相鄰。在INADEQUATE譜圖中F1與F2分別代表雙量子躍遷頻率和13C的衛(wèi)線，依次代表雙量子和單量子躍遷頻率。譜圖中一個軸是13C的化學位移，一個為雙量子躍遷頻率，其頻率正比于兩個偶合的13C核的化學位移之和的平均值。因此譜圖中F1=2F2的斜線兩側(cè)對稱分布著兩個相連的13C原子信號，表示碳偶合對的單量子平均頻率與雙量子頻率間的關(guān)系，水平連線表明一對偶合碳具有相同的雙量子躍遷頻率，可以判斷它們是直接相連的碳。依此類推可以找出化合物中所有13C原子連接順序。2DINADEQUATE譜所用脈沖序列180y90x90x13C:90φΔΔ[ψ]t12DINADEQUATE的2種形式F2域為化學位移，F(xiàn)1域為雙量子躍遷頻率，相互耦合的2個碳原子作為一對雙峰排列在平行于F2域的同一水平線上。一對耦合的碳（相當于AX體系）具有相同的雙量子躍遷頻率，用水平連線示出，如：C1-C2,C2-C3,C3-C4。由于雙量子頻率為偶合的一對13C－13C的單量子頻率之和，連線的中心落在F1=2F2的準對角線上。2143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567譜信息：F2

是碳譜，單量子頻率F1是雙量子頻率，為偶

合的一對13C－13C的單量子頻率之和一對13C－13C處于水平線上，左右對稱地處于準對角線（F1=2F2)兩側(cè)。F2域和F1域均為13C化學位移，類似于H-HCOSY譜，相互耦合的2個碳原子作為一對雙峰出現(xiàn)在對角線兩側(cè)對稱的位置上。2DINADEQUATE的2種形式4.NOESY(NuclearOverhauserEffectSpectroscopY)NOESY反映了有機化合物結(jié)構(gòu)中核與核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學鍵無關(guān)。因此對確定有機化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級結(jié)構(gòu)等）有著重要意義。NOESYNOESY的譜圖與1H-1HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實驗是由COSY實驗發(fā)展而來為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時需對照它的1H-1HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除。在相敏NOESY譜圖中交叉峰有正峰和負峰，分別表示正的NOE和負的NOE。NOESYNOESY譜所用的脈沖序列909090t1tm“inversion”NOESYNOESYHbHaHcCHbHaHcδ(f2)δ(f1)COSYOFPBFNOESYofPBFCOSY當遇到中等大小的分子時（分子量約為1000-3000），由于此時NOE的