分子標(biāo)記概述2003

DNA分子標(biāo)記目錄概述1.常用分子標(biāo)記技術(shù)原理及操作2.幾種分子標(biāo)記方法比較3.分子標(biāo)記在園藝植物中的應(yīng)用4.1、基本概念遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或者某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。是表示遺傳多樣性的有效手段，可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性。分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，直接在DNA水平上檢測生物個體之間的遺傳差異，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映常用遺傳標(biāo)記的類型細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記分子標(biāo)記3形態(tài)標(biāo)記124廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)分子標(biāo)記狹義分子標(biāo)記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段DNA分子標(biāo)記的優(yōu)勢直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題自然界存在許多等位變異，無需人為創(chuàng)造，多態(tài)性高遍布整個基因組，可檢測的基因座位是無限的理想的分子標(biāo)記具有高的多態(tài)性共顯性遺傳檢測手段簡單快速選擇中性分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組能明確辨別等位基因遍布整個基因組成本低，重復(fù)性好以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)例如SSR（1982）RAPD（1990）AP-PCR（1990）AFLP（1993）ISSR（1994）SAGE（1995）第二類分子標(biāo)記以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)例如RFLP（1974）第一類分子標(biāo)記以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)

例如SNP（1998）SRAP（2001）TRAP（2003）第三類分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)PCR技術(shù)基因組DNA限制性內(nèi)切酶引物DNA聚合酶帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動電泳核酸分子由于帶負(fù)電荷，在電場中向陽極定向運動核酸電泳PCR反應(yīng)步驟高溫變性低溫退火中溫延伸使DNA雙鏈解開讓引物與單鏈模板互補結(jié)合以互補的引物為復(fù)制起點，dNPTs為原料，進(jìn)行復(fù)制。

核酸電泳常用分子標(biāo)記方法SSRRAPDSRAPISSRRFLPSNPRFLP標(biāo)記法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）不同材料的DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性標(biāo)記的探針與膜上變性的酶切DNA進(jìn)行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間

原理

RFLP標(biāo)記特點

遍布，無限不受外界環(huán)境、發(fā)育階段、器官等影響探針多DNA需求量大，純度高技術(shù)要求高，成本大RFLP標(biāo)記基本步驟DNA雜交及放射自顯影Southern印記轉(zhuǎn)移瓊脂糖凝膠電泳酶切DNA的分離

RAPD標(biāo)記法（RandomAmplifiedPolymorphismDNA）以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以一系列人工合成的不同的隨機排列順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR酶促體外擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色（或銀染、放射自顯影）來檢驗擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。原理RAPD標(biāo)記特點試驗步驟少沒有物種特異性技術(shù)簡便DNA樣品量少存在共遷移問題重復(fù)性不高顯現(xiàn)標(biāo)記易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性ADNA的提取B用隨機引物對兩個相對性狀個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增C用凝膠電泳分開產(chǎn)物DNA片段D查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段RAPD標(biāo)記基本步驟SSR標(biāo)記法（simplesequencerepeat）根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。

原理SSR原理

?

重復(fù)單元：1~6bp,如

CA,CTCG

?

重復(fù)次數(shù)：5~30次

?

覆蓋長度：10~300bpSSR標(biāo)記特點1.數(shù)量多且平均分布2.位于內(nèi)含子中3.共顯現(xiàn)遺傳4.結(jié)果重復(fù)性高5.引物問題SSR標(biāo)記的步驟TwoThreeOne構(gòu)建小片段或大片段的基因組篩選陽性克隆測序、設(shè)計引物、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，獲得的陽性克隆經(jīng)過確認(rèn)后，全部或經(jīng)過隨機挑選后測序，然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)保守區(qū)域的序列設(shè)計引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件，獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記法（inter-simplesequencerepeat）在SSR的3’或5’端加錨1~4個嘌呤或嘧啶堿基,引起特定位點退火,使引物與匹配SSR的一端結(jié)合,從而對基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增、檢測,最后根據(jù)譜帶的有無及相對位置分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性。原理

5’錨定引物3’錨定引物

NNNN（CA）n（CA）nNNCACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACA

NNn（CA）

（CA）nNNNN3’錨定引物5’錨定引物

3’錨定引物的PCR產(chǎn)物5’錨定引物的PCR產(chǎn)物ISSR標(biāo)記特點FiveFourThreeTwoOne技術(shù)簡單檢測迅速，容易靈敏度高，特異性強具有高的多態(tài)性

穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好用6%的聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳分離，用EB或銀染后放入可見光或紫外光下觀察，統(tǒng)計帶紋的有無及相對位置。在PCR儀上對基因組中的SSR間序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增步驟與RAPD技術(shù)相似,但不同引物、不同植物材料的擴(kuò)增條件存在差異,需通過預(yù)備實驗對體系反應(yīng)加以設(shè)計可采用常規(guī)方取用于ISSR分析的DNA樣品,如SDS法或CTAB法DNA提取PCR擴(kuò)增電泳檢測SRAP標(biāo)記法（Sequence—relatedAmplifiedPolymorphism）

利用基因外顯子里G、C含量豐富，而啟動子和內(nèi)含子里A、T含量豐富的特點設(shè)計兩套引物，對開放讀碼框架（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增。原理SRAP標(biāo)記特點技術(shù)簡單快速引物設(shè)計簡單具高多態(tài)性信息量豐富在基因組中分布均勻穩(wěn)定可靠重復(fù)性好ONETWOTHREEFOURSRAP標(biāo)記的引物設(shè)計SRAP-PCR擴(kuò)增凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與片段測序

SRAP標(biāo)記的步驟SNP標(biāo)記（SingleNucleotidePolymorphism）原理

單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等

不同生物個體基因組DNA序列之間單個核苷酸的差異，這種差異可以通過設(shè)計特異PCR引物擴(kuò)增和電泳檢測顯示出來。位點豐富、分布廣泛具有更高的遺傳穩(wěn)定性，尤其是處于編碼區(qū)的SNP檢測快速、易于實現(xiàn)自動化分析富有代表性二態(tài)性和等位基因性SNP標(biāo)記特點6種分子標(biāo)記方法比較DNA質(zhì)量要求DNA檢測范圍遺傳特點多態(tài)性技術(shù)難度及重復(fù)性RFLP高低拷貝區(qū)共顯性中等高、高RAPD低整個基因組顯性較高中等、低SSR中高重復(fù)序列區(qū)共顯性高低、高ISSR中高重復(fù)序列區(qū)顯性高低、低SRAP低整個基因組共顯性高低、低SNP高整個基因組共顯性高高、高RFLP標(biāo)記的應(yīng)用

構(gòu)建基因組遺傳圖譜及育種1

基因定位及基因突變分析

2

遺傳多態(tài)性分析3

細(xì)胞質(zhì)遺傳研究4莊杰云等選用覆蓋整個水稻遺傳圖譜的129和106個DNA探針,分別分析了汕稻品系IR54、5460、5460S之間和粳稻品系農(nóng)墾58

、農(nóng)墾58s及其育性回復(fù)突變系之間的RFLp。結(jié)果表明人工誘變能引起水稻染色體組各座位同時發(fā)生廣泛的非致死性突變;自發(fā)突變較普遍,且多為回復(fù)突變。農(nóng)墾58等3個粳稻品系之間的差異較小,但具有類似的趨勢。應(yīng)用舉例RAPD標(biāo)記的應(yīng)用天然居群內(nèi)及居群間的遺傳變異種質(zhì)資源搜集及品種鑒定種間或?qū)匍g親緣關(guān)系遺傳圖譜構(gòu)建基因定位與分離等尹艷杰等利用RAPD標(biāo)記分析了桂林市23個桂花品種的親緣關(guān)系，研究表明，4個品種群內(nèi)的不同品種間的親緣關(guān)系接近，而不同品種群間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中圓瓣金桂、桃葉金桂、湘金桂、金蓮首先聚為一類，被命名為金桂品種群;南溪丹桂、貴妃紅、籽丹桂、丹心被劃分為丹桂品種群:四季桂、月月桂屬于四季桂品種群，其余的品種，如紫粵、滿天星、弄潮兒等都屬于銀桂品種群應(yīng)用舉例SSR標(biāo)記的應(yīng)用生物雜交育種及純度鑒定01遺傳連鎖圖譜02種群遺傳多樣性03系統(tǒng)發(fā)生等04應(yīng)用舉例

張敏等采用SSR標(biāo)記技術(shù)，選用100對引物在鄂茄子2號親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增．從中篩選出的3對引物SMl7、SM29、SM51在雙親本間能夠擴(kuò)增出差異互補的條帶。利用這3對引物對鄂茄子2號雜種一代群體進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果為97．1％；與同批次種子的田間鑒定結(jié)果(96．1％)接近，說明應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)實施茄子雜種一代種子的純度鑒定是可行的．ISSR標(biāo)記的應(yīng)用群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究遺傳作圖與基因定位品種和種質(zhì)鑒定物種和種群親緣關(guān)系研究品種純度鑒定李嚴(yán)龍等將金葉女貞和平抗金葉女利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定發(fā)生變異的平抗金葉女貞品種。結(jié)果表明，平抗金葉女貞為金葉女貞品種在某一基因位點發(fā)生基因突變產(chǎn)生的單位點自然變異品種。應(yīng)用舉例SRAP標(biāo)記的應(yīng)用1

構(gòu)建遺傳圖譜2

遺傳多樣性分析3

比較基因組學(xué)4

標(biāo)定基因等楊建用RAP分子標(biāo)記，以鵝掌楸種間雜交(BMxS)Fl代群體為材料，構(gòu)建了一張鵝掌楸分子標(biāo)記連鎖遺傳圖。并