土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)評(píng)優(yōu)課用

1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕浮菊n題背景】CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH33、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照研究思路包括哪些環(huán)節(jié)？

1、自然界中篩選菌株實(shí)例：?jiǎn)⑹荆涸颍篋NA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株美國黃石國家公園的一個(gè)熱泉因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物，只有Taq細(xì)菌被篩選出來。尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。如果請(qǐng)你來尋找這種耐高溫的酶，你會(huì)去哪里尋找？為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來呢？方法：⑴抑制大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)⑵造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。1.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M常用方法：稀釋涂布平板法（1）原理：（2）計(jì)算：1個(gè)菌落1個(gè)活菌稀釋度足夠高固體培養(yǎng)基C：某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)M：稀釋倍數(shù)二、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4

B兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯(cuò)在哪？甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板）？乙：A組結(jié)果誤差過大，意味著操作有誤，不應(yīng)用于計(jì)算平均值,需要重新實(shí)驗(yàn)（3）注意事項(xiàng)①選30～300個(gè)菌落的平板統(tǒng)計(jì)③統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示：每克樣品中的菌落數(shù)④菌落數(shù)活菌的實(shí)際數(shù)＜②每個(gè)稀釋度取3個(gè)平板取其平均值——重復(fù)實(shí)驗(yàn)2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)：

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造

注意事項(xiàng)取樣時(shí)先要搖勻菌液；使用時(shí)先蓋上蓋玻片，再沿蓋玻片邊緣凹槽滴加菌液，讓菌液自行滲入計(jì)數(shù)室；一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5-10個(gè)菌體為宜；每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（4個(gè)角和中央）計(jì)數(shù)；位于格線上的菌體一般數(shù)上不數(shù)下，數(shù)右不數(shù)左；血球計(jì)數(shù)板使用完畢，用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，以免損壞網(wǎng)格刻度；洗凈后自行晾干或吹風(fēng)機(jī)吹干。1ml菌液中的總菌數(shù)=？

答案：(3+4+4+3+2)／5×25×104=8×105個(gè)/ml25中格X16小格1.目的（三）設(shè)置對(duì)照排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度（1）判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。（2）判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）與選擇培養(yǎng)基同時(shí)接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。2.方法三.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）原理：尿素細(xì)菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方案、材料用具、實(shí)施步驟和時(shí)間安排等。（3）實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣

樣品系列稀釋

涂布平板與培養(yǎng)

觀察并記錄結(jié)果菌落計(jì)數(shù)（4）實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基?！魬?yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度㈢.樣品的稀釋原因：目的：不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間。細(xì)菌：放線菌：霉菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d25～28℃培養(yǎng)5～7d25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。微生物的培養(yǎng)與觀察四、操作提示

無菌操作

做好標(biāo)記

規(guī)劃時(shí)間

1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。對(duì)于耗時(shí)較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高工作效率，在操作時(shí)更加有條不紊。五.課外延伸

細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成氨使培養(yǎng)基的pH升高。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，如果指示劑變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)深紫色（或黑色），通過記數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈綠色，有金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征

本課題知識(shí)小結(jié):1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.至少接種一種細(xì)菌

C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練A

CD4.下列說法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC

6、測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量一般選104、105、106

倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；而真菌的數(shù)量，一般選用102、103、104

倍稀釋，其原因是

（）

A細(xì)菌個(gè)體小，真菌個(gè)體大

B細(xì)菌易稀釋真菌不易稀釋

C細(xì)菌在土壤中含量比真菌高

D隨機(jī)的，沒有原因7、用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目，其結(jié)果與實(shí)際值相比（）

A.比實(shí)際值高

B.比實(shí)際值低

C.和實(shí)際值一致

D.比實(shí)際值可能高也可能低B8、某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml）()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4

B9、下列能選擇出分解尿