細胞培養(yǎng)講課ppt

細胞培養(yǎng)技術主要內容1.細胞培養(yǎng)技術的相關概念2.細胞培養(yǎng)過程中的污染3.如何應對這些問題基本概念

細胞培養(yǎng)：指細胞在體外條件下，摸擬體內生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)培養(yǎng)和增值。

原代培養(yǎng)：培養(yǎng)的動物細胞大都取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細胞，然后配制成一定濃度的細胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的細胞在傳至10代左右時就由于很多細胞不適應外界環(huán)境而不分裂，但有些細胞適應外界環(huán)境而仍然分裂生長，這樣的細胞稱細胞株，細胞系：當細胞培養(yǎng)至50代左右后，一般的細胞再也培養(yǎng)下去了，只有遺傳物質發(fā)生改變的細胞而變成不死細胞繼續(xù)活下去了。這樣形成的細胞叫細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)?；靖拍罴毎麍D樣低倍顯微鏡高倍顯微鏡體外培養(yǎng)細胞的分型（一）貼附型細胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependentcells)這種現象與細胞分化有關。按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)可分為成纖維細胞型，上皮型細胞，游走細胞型，多形型細胞細胞貼壁過程（二）懸浮型

特點：不貼附在支持物生長，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間的生長，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。S180肉瘤、血液里的白細胞、K562、HL－60。分型的目的：方便描述細胞在培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時，細胞相對穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細胞生物學性狀指標。細胞培養(yǎng)中的污染一、細菌污染

細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現菌體才知污染。所以，每天應仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。細胞培養(yǎng)中的污染二、真菌污染

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。細胞培養(yǎng)中的污染三、支原體污染支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開始不易發(fā)現，能在偏堿條件(pH7.6-8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結構，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。常用的排除微生物污染的方法細菌污染小可用慶大霉素50~100ug/ml，萬古霉素50ug/ml，氨卡青霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液。重度污染只有倒掉。支原體呈淺黑色“泥沙狀”，可影響細胞的生長，使用卡那霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液，連續(xù)2周，能控制支原體。如果重度污染只有倒掉。真菌污染一般用氨卡青霉素50~100ug/ml，慶大霉素50~100ug/ml，制霉菌素1.5ug/ml加入培養(yǎng)液中對霉菌污染的細胞進行大劑量沖擊處理，10小時后換液，能有效抑制霉菌的污染。應對方法

一、無菌的培養(yǎng)環(huán)境和齊全的設備----細胞培養(yǎng)房的條件是關鍵TextTextTextText超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。主要設備主要設備按構造分：正置顯微鏡

倒置顯微鏡二、規(guī)范的操作程序--所用器械要嚴按照規(guī)范的操作過程執(zhí)行酒精燈離心管培養(yǎng)瓶鑷子

三、常用試劑的制備酒精燈TEXTTEXT培養(yǎng)瓶1、常用培養(yǎng)基。我們實驗中的均有公司提供

注：關注實際試驗操作中的經驗，關注PH值變化2、血清的選擇與配置。小牛血清或胎牛血清培養(yǎng)細胞時從-20℃到4℃逐漸溶解，避免冷熱變化3、EDTA的配置4、胰蛋白酶配置-20℃冰箱保存四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應注意的事項一：

細胞復蘇過程中的一系列操作，要求動作迅速，復蘇的時間的長短與細胞存活率成正比，并且要先在37度水浴鍋中預熱，復蘇前細胞房嚴格消毒。四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應注意的事項二：

在細胞的傳代培養(yǎng)中不能太多，細胞生長旺盛達到瓶底四分之三，但也不能太少。傳代時把培養(yǎng)瓶內的液體輕輕倒掉，按胰蛋白酶與EDTA按1：1的混合物，（細胞消化的時間短，消化徹底且對細胞損傷?。毎M行消化。置室溫內消化3~5分鐘后按常規(guī)操作進行傳代。四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應注意的事項三：

冷凍經過水液態(tài)—冰態(tài)加水態(tài)—冰態(tài)三個階段，降溫的速率十分重要，按照4℃冰箱40min，-20℃冰箱60min，-80℃冰箱內過存或液氮罐長期保存

注意：上述過程中要去掉上清液的時一定輕輕倒掉或用移液管吸掉培養(yǎng)液，過重、過快容易把細胞也去掉。五污染的防治（見前面）六細胞室要制定嚴格的規(guī)章制度，每天進行消毒，保持