細(xì)胞培養(yǎng)講課ppt

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容1.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)概念2.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染3.如何應(yīng)對(duì)這些問題基本概念

細(xì)胞培養(yǎng)：指細(xì)胞在體外條件下，摸擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外繼續(xù)培養(yǎng)和增值。

原代培養(yǎng)：培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞大都取自動(dòng)物胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織，將組織取出來(lái)后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個(gè)過(guò)程稱為原代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞株：原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在傳至10代左右時(shí)就由于很多細(xì)胞不適應(yīng)外界環(huán)境而不分裂，但有些細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境而仍然分裂生長(zhǎng)，這樣的細(xì)胞稱細(xì)胞株，細(xì)胞系：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至50代左右后，一般的細(xì)胞再也培養(yǎng)下去了，只有遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞而變成不死細(xì)胞繼續(xù)活下去了。這樣形成的細(xì)胞叫細(xì)胞系。細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)?；靖拍罴?xì)胞圖樣低倍顯微鏡高倍顯微鏡體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（一）貼附型細(xì)胞貼附在支持物表面生長(zhǎng)，只依賴貼附才能生長(zhǎng)的細(xì)胞叫做貼附型細(xì)胞(Anchorrage-dependentcells)這種現(xiàn)象與細(xì)胞分化有關(guān)。按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)可分為成纖維細(xì)胞型，上皮型細(xì)胞，游走細(xì)胞型，多形型細(xì)胞細(xì)胞貼壁過(guò)程（二）懸浮型

特點(diǎn)：不貼附在支持物生長(zhǎng)，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)空間大，可長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)，繁殖旺盛便于做細(xì)胞代謝研究。S180肉瘤、血液里的白細(xì)胞、K562、HL－60。分型的目的：方便描述細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時(shí)，細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細(xì)胞生物學(xué)性狀指標(biāo)。細(xì)胞培養(yǎng)中的污染一、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。細(xì)胞培養(yǎng)中的污染二、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。細(xì)胞培養(yǎng)中的污染三、支原體污染支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6-8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。常用的排除微生物污染的方法細(xì)菌污染小可用慶大霉素50~100ug/ml，萬(wàn)古霉素50ug/ml，氨卡青霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液。重度污染只有倒掉。支原體呈淺黑色“泥沙狀”，可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，使用卡那霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液，連續(xù)2周，能控制支原體。如果重度污染只有倒掉。真菌污染一般用氨卡青霉素50~100ug/ml，慶大霉素50~100ug/ml，制霉菌素1.5ug/ml加入培養(yǎng)液中對(duì)霉菌污染的細(xì)胞進(jìn)行大劑量沖擊處理，10小時(shí)后換液，能有效抑制霉菌的污染。應(yīng)對(duì)方法

一、無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境和齊全的設(shè)備----細(xì)胞培養(yǎng)房的條件是關(guān)鍵TextTextTextText超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。主要設(shè)備主要設(shè)備按構(gòu)造分：正置顯微鏡

倒置顯微鏡二、規(guī)范的操作程序--所用器械要嚴(yán)按照規(guī)范的操作過(guò)程執(zhí)行酒精燈離心管培養(yǎng)瓶鑷子

三、常用試劑的制備酒精燈TEXTTEXT培養(yǎng)瓶1、常用培養(yǎng)基。我們實(shí)驗(yàn)中的均有公司提供

注：關(guān)注實(shí)際試驗(yàn)操作中的經(jīng)驗(yàn)，關(guān)注PH值變化2、血清的選擇與配置。小牛血清或胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)從-20℃到4℃逐漸溶解，避免冷熱變化3、EDTA的配置4、胰蛋白酶配置-20℃冰箱保存四、貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)一：

細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中的一系列操作，要求動(dòng)作迅速，復(fù)蘇的時(shí)間的長(zhǎng)短與細(xì)胞存活率成正比，并且要先在37度水浴鍋中預(yù)熱，復(fù)蘇前細(xì)胞房嚴(yán)格消毒。四、貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)二：

在細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中不能太多，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛達(dá)到瓶底四分之三，但也不能太少。傳代時(shí)把培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的液體輕輕倒掉，按胰蛋白酶與EDTA按1：1的混合物，（細(xì)胞消化的時(shí)間短，消化徹底且對(duì)細(xì)胞損傷?。?duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。置室溫內(nèi)消化3~5分鐘后按常規(guī)操作進(jìn)行傳代。四、貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)三：

冷凍經(jīng)過(guò)水液態(tài)—冰態(tài)加水態(tài)—冰態(tài)三個(gè)階段，降溫的速率十分重要，按照4℃冰箱40min，-20℃冰箱60min，-80℃冰箱內(nèi)過(guò)存或液氮罐長(zhǎng)期保存

注意：上述過(guò)程中要去掉上清液的時(shí)一定輕輕倒掉或用移液管吸掉培養(yǎng)液，過(guò)重、過(guò)快容易把細(xì)胞也去掉。五污染的防治（見前面）六細(xì)胞室要制定嚴(yán)格的規(guī)章制度，每天進(jìn)行消毒，保持