干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

產(chǎn)品經(jīng)理：施真解析：干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

主要內(nèi)容1.干細(xì)胞原代提取及鑒定2.干細(xì)胞培養(yǎng)體系與操作細(xì)節(jié)的重要性3.OricellTM系列干細(xì)胞產(chǎn)品及售后服務(wù)2原代培養(yǎng)過(guò)程3原代取材組織來(lái)源（個(gè)體年齡、健康狀況）

BMSC、ADSC：成人（18-45周歲）、大鼠和小鼠（4周齡）、兔和狗（1-3周齡）

NSC：大鼠（孕齡14.5天的胚胎）；小鼠（孕齡12.5天的胚胎）

ESC：小鼠（見(jiàn)栓后3.5天的孕鼠）取材部位

BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和脛骨

ADSC：抽脂手術(shù)的脂肪組織或腹股溝

NSC：胚胎大腦GE區(qū)

ESC：囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)45間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）定義：來(lái)源于中胚層的早期細(xì)胞，能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的細(xì)胞。來(lái)源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來(lái)源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。6廣泛存在于成年或胚胎哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）7胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcellES,細(xì)胞)是指胚泡期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細(xì)胞無(wú)限增殖、自我更新可分化為三個(gè)胚層來(lái)源的各種組織及細(xì)胞類(lèi)型胚胎干細(xì)胞（ESC）分離細(xì)胞分離方法的選擇BMSC：密度梯度離心法（人、猴、狗）

貼壁篩選法（大鼠、小鼠、兔）ADSC：膠原酶消化法NSC：無(wú)血清培養(yǎng)基自然篩選法ESC：囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)遷移法8密度梯度離心法密度梯度離心法：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。試劑：

Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，分離出密度在1.077±0.001g/L之間的淋巴細(xì)胞9用1xPBS按照

1：1的比例稀釋骨髓；稀釋后的骨髓沿離心管壁緩慢鋪到淋巴細(xì)胞分離液上；離心；離心完畢，小心吸取中間云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層；離心，加入培養(yǎng)基重懸接種；3天之后首次換液；其后，每隔2-3天換液；待細(xì)胞到80%融合的時(shí)候進(jìn)行傳代。10密度梯度離心法11取大鼠/小鼠的后肢股骨和脛骨；用1mL注射器吸入培養(yǎng)基后沖洗骨髓腔，將骨髓全部沖洗出來(lái)；骨髓懸液進(jìn)行離心；棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到1個(gè)T25或者T75培養(yǎng)瓶中；3天后換液，以后每隔2-3天換液，待細(xì)胞80-90％融合時(shí)傳代。貼壁篩選法擴(kuò)增傳代傳代時(shí)機(jī)的控制（MSC為例）細(xì)胞匯合度的判斷傳代消化時(shí)間的控制接種密度的控制培養(yǎng)體系的選擇12擴(kuò)增傳代-細(xì)胞匯合度的判斷(MSC)

13擴(kuò)增傳代-消化時(shí)間的控制(MSC)14細(xì)胞消化15s細(xì)胞消化35s細(xì)胞消化55s不同物種、細(xì)胞類(lèi)型之間接種密度有差異MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2NSC：1.0-2.0×105cells/mLESC：1×104/cm2~2×104/cm215擴(kuò)增傳代-接種密度的控制純化鑒定16純化方法：多次傳代進(jìn)行純化常規(guī)檢測(cè)：細(xì)菌、真菌檢測(cè)；支原體檢測(cè)；內(nèi)毒素檢測(cè)；鑒定檢測(cè)：增殖能力、生長(zhǎng)形態(tài)、特異性抗原表達(dá)、核型分析、誘導(dǎo)分化能力等常規(guī)檢測(cè)17鑒定檢測(cè)共通項(xiàng)目復(fù)蘇存活率

臺(tái)盼藍(lán)拒染法--如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。18鑒定檢測(cè)共通項(xiàng)目19細(xì)胞倍增時(shí)間：生長(zhǎng)曲線測(cè)定（計(jì)數(shù)法或者CCK8法)細(xì)胞倍增的時(shí)間區(qū)間即細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)等多應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。可在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期找出細(xì)胞增加一倍所需的時(shí)間，即倍增時(shí)間。形態(tài)學(xué)表面抗原標(biāo)記多向分化能力20MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)形態(tài)學(xué):梭形、成纖維樣細(xì)胞原代：克隆樣生長(zhǎng)傳代后：均質(zhì)、旋渦狀排列21HumanDogMonkeyMouseRatRabbitMSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)表面抗原標(biāo)記（流式鑒定）：

MSCs屬混雜細(xì)胞群，其表面抗原也具有非專一性,它表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，如粘附因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體以及整合素家族等。22MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)23MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)誘導(dǎo)分化能力鑒定：成骨誘導(dǎo)（茜素紅染色）24誘導(dǎo)前（匯合度65%-70%）染色前成骨誘導(dǎo)25MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)誘導(dǎo)分化能力鑒定：成脂誘導(dǎo)（油紅O染色）26誘導(dǎo)前（融合度90-95%）成脂染色前誘導(dǎo)分化能力鑒定：成軟骨誘導(dǎo)（阿利新藍(lán)染色、三維培養(yǎng)法）27MSC（間質(zhì)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)染色前石蠟切片后染色圖片形態(tài)學(xué)特征：可做懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)特異性抗原表達(dá)：Nestin分化能力：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞28NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)29大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-懸浮培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-懸浮培養(yǎng)NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)-形態(tài)學(xué)30NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)特異性抗原表達(dá)Nestin(神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物)陽(yáng)性表達(dá)率≥75%

β3-tubulin（神經(jīng)元標(biāo)志物）陽(yáng)性表達(dá)率

≤10%GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)陽(yáng)性表達(dá)率≤10%GalC或OSP（少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）陽(yáng)性表達(dá)率≤10%31NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)RatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining分化能力自然分化

加入含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)約7天，可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。三者的分化比例約為(16±7)%，(75±7)%和(5±3)%。定向分化

1.神經(jīng)元方向分化：用無(wú)血清無(wú)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，可使分化比例升至60%以上。2.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。32NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)33神經(jīng)元方向分化（TubulinStaining)星型膠質(zhì)細(xì)胞方向分化（GFAPStaining)RatNSCNSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)34少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化（OSPStaining）NSC（神經(jīng)干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)形態(tài)學(xué)：集落樣或克隆樣生長(zhǎng)特異性轉(zhuǎn)錄因子/抗原表達(dá)：表達(dá)OCT-4，Nanog；SSEA種屬間表達(dá)有差異染色體結(jié)構(gòu)：傳代過(guò)程中保持正常穩(wěn)定的核型全能性：具有向胚胎的三個(gè)胚層來(lái)源的所有細(xì)胞分化的能力35ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)36小鼠ES：緊密牢固結(jié)合、多層密集立體生長(zhǎng)，呈堆積狀，邊緣清楚，細(xì)胞核大、核仁明顯、核漿比高。

人ES：相對(duì)松散、扁平狀集落,集落內(nèi)細(xì)胞界限隱約可見(jiàn)ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)-形態(tài)學(xué)有MEF

無(wú)MEF，無(wú)血清培養(yǎng)體系

特異性表達(dá)37抗原Oct-4NanogSSEA-1SSEA-3SSEA-4人ES++—++小鼠ES+++——ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型，小鼠（40，XX/XY)。不隨傳代次數(shù)而改變。38ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)39小鼠ES核型分析：40，XYESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)核型分析：顯色技術(shù)全能性體內(nèi)分化：畸胎瘤實(shí)驗(yàn)體外分化：EB（擬胚體）形成實(shí)驗(yàn)40ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)體內(nèi)分化41將細(xì)胞注射入（約106個(gè)）SCID（重癥聯(lián)合免疫缺陷）或裸鼠體內(nèi)，約4周后（人ES可能需要8~10周），可見(jiàn)細(xì)胞注射處有腫塊生成，處死小鼠，腫瘤固定后做石蠟包埋，切片，普通HE染色后觀察。ES可在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)、分化、形成含有三個(gè)胚層來(lái)源的良性畸胎瘤。ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)體外分化42ESEB貼壁誘導(dǎo)約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動(dòng)ESC（胚胎干細(xì)胞）鑒定檢測(cè)43剛接觸干細(xì)胞，不知道該用什么培養(yǎng)基？費(fèi)盡心血提取的干細(xì)胞養(yǎng)了幾代就老化了？原代取材雜細(xì)胞太多？細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻，有的地方密有的地方??？操作其他細(xì)胞都沒(méi)問(wèn)題，養(yǎng)干細(xì)胞就出現(xiàn)了污染？

………….干細(xì)胞培養(yǎng)體系與操作細(xì)節(jié)的重要性44

干細(xì)胞的研究和利用過(guò)程中，最主要的提供最適生長(zhǎng)環(huán)境，保持培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)細(xì)胞群體的狀態(tài)，這就要求培養(yǎng)條件始終如一，近乎呆板地堅(jiān)守細(xì)節(jié)和常規(guī)。

培養(yǎng)體系的選擇干細(xì)胞飼養(yǎng)員必備素質(zhì)-細(xì)節(jié)決定成敗無(wú)菌意識(shí)，重中之重規(guī)范化的無(wú)菌操作超凈臺(tái)取用物品擺放、操作時(shí)細(xì)節(jié)問(wèn)題環(huán)境的控制

培養(yǎng)箱的定期消毒、水浴鍋定期換水、大環(huán)境的控制等生物試劑使用前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作干細(xì)胞時(shí)動(dòng)作輕柔復(fù)蘇、傳代、凍存等步驟重懸細(xì)胞的過(guò)程培養(yǎng)基使用前復(fù)溫、細(xì)胞接種之后搖勻、各種干細(xì)胞接種密度的控制、試劑保存時(shí)避免反復(fù)凍融等4546

干細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)耗材、分子耗材培養(yǎng)基細(xì)胞因子

凍存液OricellTM系列干細(xì)胞產(chǎn)品及售后服務(wù)干細(xì)胞相關(guān)試劑及耗材47OricellTM系列無(wú)蛋白非程序凍存液4849細(xì)胞培養(yǎng)耗材的選擇干細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶

（特殊TC處理表面，更適用于干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)）神經(jīng)元/神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)板

（多肽包被，無(wú)需PLL/Laminin預(yù)處理，保存時(shí)間長(zhǎng)）15ml、50ml離心管（透明度更高、耐更高轉(zhuǎn)速）分子生物學(xué)耗材（

Labcon系列）全美進(jìn)口●55周年歷史●FDA/USP認(rèn)證吸頭微量離心管PCR產(chǎn)品系列儲(chǔ)樣管、儲(chǔ)樣架等OricellTM系列耗材Cyagen團(tuán)隊(duì)特別針對(duì)免疫