植物表達載體構建

植物表達載體構建張玉剛zyg4458@163.com載體vector表達載體載體克隆載體原核表達載體真核表達載體植物表達載體質粒圖譜及質粒構建啟動子外源基因終止子啟動子報告基因終止子

（標記基因）

目的片段選擇標記

載體表達載體(expressingvector)特點：帶表達構件—轉錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達載體：含啟動子—核糖體結合位點—克隆位點—轉錄終止信號啟動子：trp-lac(tac)啟動子、λ噬菌體PL啟動子、T7噬菌體啟動子核糖體結合位點(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉錄終止序列在植物表達載體Ti質粒的結構：侵染植物的土壤農桿菌中帶有Ti質粒，侵染植物后會產生冠癭瘤。Ti質粒上有一段transfer-DNA,長為12-24kb，能轉移并整合到植物基因組中。Virgene復制起始位點冠癭堿代謝基因右邊界(25bp)左邊界生長素基因細胞分裂素基因冠癭堿合成基因Vir基因產物可誘導Ti質粒產生T-DNA區(qū)域的單鏈線性拷貝，在其他如VIRD2,VIRD4,VIRB等蛋白的協(xié)助下，穿越農桿菌及植物細胞的細胞壁、膜等，最后整合到染色體中。T-DNA的左右邊界各有25bp的重復序列，但右邊界對T-DNA的整合更為重要。有一些早期的植物轉化載體并不含有左邊界。T-DNA區(qū)域的大部分基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才表達，表達產物與冠癭瘤的形成有關。Ti質粒作為轉基因載體的缺陷：---轉化后會產生植物激素，阻礙轉化細胞的再生；---冠癭堿合成基因對轉基因植物意義不大；----Ti質粒長約200-800kb,過于龐大；----Ti質粒不能在大腸桿菌中復制。

雙元載體不帶有vir基因，但帶有大腸桿菌及土壤農桿菌的復制起始位點。所有基因操作可以在大腸桿菌中完成，之后轉入一種經修飾后的Ti質粒農桿菌中，該Ti質粒包含一整套vir,但缺失T-DNA序列而無法轉移，這樣可提供僅vir基因產物幫助雙元載體轉移。

共整合載體已很少用。外源基因首先克隆到一個克隆載體上，該載體含有一段與缺失T-DNA的Ti質粒有同源序列。當該載體進入土壤農桿菌后，與Ti質粒整合，然后由Ti質粒提供T-DNA向植物細胞轉移的vir基因產物。病毒衍生載體比較小，易侵染植物并大量擴增，可大量表達蛋白，但一般難于整合到植物基因組中。

啟動子35S,Nos,others蛋白質定位：GFP融合蛋白，GUS融合蛋白基因表達：啟動子-GUS（蛋白）,啟動子-GFP（蛋白）。啟動子的種類組成型啟動子誘導型啟動子組織特異型啟動子在某些情況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性Constitutivepromoter在該類型啟動子控制下，結構基因的表達大體恒定在一定水平下，在不同組織部位表達水平沒有明顯差異。特點：表達具持續(xù)性；tRNA和蛋白質表達量相對恒定；它們不表現時空特異性；不受外界因素的誘導；從結構上看，大多數組成型啟動子轉錄起始位點上游幾百個核苷酸處，存在有六聚體花紋（hexamermotifs)序列TGACTG。它們以重復形式出現并被6-8個核苷酸隔開，缺失及點突變分析表明六聚體花紋的存在對維持啟動子的轉錄活性是必要的。CaMV35S啟動子來自花椰菜花葉病毒，由于啟動整個CaMV基因組的一小段重疊序列轉錄產物的沉降系數為35S，故將編碼該轉錄產物的啟動子稱之為35S啟動子。該啟動子包括TATA盒、CAAT盒、倒轉重復序列和增強子核心序列（GTGG/TTTG）。35S可以劃分為兩個區(qū)域：A區(qū)：-90~+8主要負責在胚根、胚乳的根及根組織內表達；B區(qū)：-343~-90主要控制胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內表達。B區(qū)內的增強子序列可以提高表達水平，如果35S啟動子中存在兩個B區(qū)將能使35S啟動子的活性提高10倍，并對異源啟動子也有作用。-75處TGACGT核苷酸的重復的花紋結構對啟動子表達能力有作用，如果其突變，將引起核因子與其結合力下降，導致啟動子表達能力減弱。CaMV35S啟動子加上來自AMV的一段44bp的引導序列，可使其表達強度增加5倍（44bp序列是翻譯增強序列）。將加倍的CaMV35S啟動子與AMV引導序列結合構成一個復合串聯(lián)啟動子，比未修飾的啟動子表達增強20倍。Tissuespecificpromoter在這些啟動子調控下，基因的表達只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并通常表現出發(fā)育調節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細胞結構和化學物理信號為存在基礎。與誘導型啟動子有一定的共同點。馬鈴薯塊莖特異蛋白基因啟動子小麥胚乳特異表達的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucosepyrphosphorylase)啟動子番茄果實成熟特異性表達的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)啟動子花粉特異表達基因啟動子（lat52）木質部特異表達的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)啟動子Induciblepromoter在某些特定的物理或化學信號的刺激下，此種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平，因此，稱為誘導型調節(jié)序列。共同特點啟動子的活化受到物理或化學信號的誘導；啟動子的分子結構都具有增強子、沉默子或類似功能的序列結構；感受特異性誘導的序列都有明顯的專一性；一部分該類型的啟動子同時具有組織特異性表達的特點；該類啟動子常以誘導信號命名，可分為光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子。三種類型A型：可以被植物體內合成的某些產物包括ABA、生長素、赤霉素以及創(chuàng)傷誘發(fā)產生的系統(tǒng)素所誘導；B型：在高溫、低溫、水淹以及土壤中高濃度的鹽以及重金屬離子等環(huán)境因子的作用下可被誘導；C型：一類能夠對人工合成的化學誘導物，諸如四環(huán)素、地塞米松等作出反應。光誘導啟動子核酮糖二磷酸羧化酶小亞基（SSrbc)基因和光撲獲復合物a/b結合蛋白（lightharvestingcomplexproteina/b,LHCPa/b)基因。這兩個基因均由核基因編碼，并在胞漿內合成含有信號肽的前體蛋白，最終輸入到葉綠體發(fā)揮生物學功能。熱誘導啟動子當植物暴露在高溫下（通常35以上）或稱熱休克時，植物就會在1-3小時內暫時合成一些蛋白質或增大特異蛋白質的合成量，這些誘導下合成的蛋白質成為熱休克蛋白。熱激基因的結構分析：這些基因的5'端有一段保守的熱激共有序列，也稱為熱休克因子序列（HSE）。其含有熱誘導基因表達的調控序列。植物基因工程常用的報告基因指其編碼產物能夠被快速地測定、常用來判斷外源基因是否已經成功地導入寄主細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。作為報告基因的條件在轉化的寄主細胞中應不存在相應的內源等位基因的活性，其表達產物不僅不會損害寄主細胞，而且還應具有快速、靈敏、定量和可重復的檢測特性。報告基因1、綠色熒光蛋白基因（GFPgreenfluorescenceprotein）2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-glucuronidase）3、熒光素酶基因（LUCfireflyluciferase）4、氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT基因）5、抗生素基因JellyfishAequoreavictoria:oneoftheoldestspeciesontheearth

GreenFluorescentProtein(GFP)

ThisisastereoviewofGFPgeneratedfromtheBrookhavenDatabaseusingRIfyouhavetheChyoumayfollowthelinkstoseeGFPinaction!Lastupdated(c)1997RWZELLERGUS酶的底物是無色的X-葡萄糖苷酸（X-glucuronide,X-gluc)GUS酶的顯色反應以底物不同而不同：5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide靛藍5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide橘紅4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide熒光產物B-glucuronidase(GUS)檢測方法用于GUS基因檢測的常用底物有三種：X-Gluc5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯X-MUG4-甲基傘形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯

PNPG對硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷組織化學染色定位法熒光法測定GUS活性分光光度法測定GUS活性組織化學染色定位法該方法是將底物進入被測的植物組織。將被檢材料浸泡在含有底物的緩沖葉中保溫，在適宜條件下該酶可將X-Gluc水解生成藍色物質。初始產物并不帶有顏色，為無色的吲哚衍生物，后經氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯靛藍染料，使具有Gus活性的部位或位點呈現藍色。注意：在測定時，由于植物體內的過氧化物酶能促進氧化二聚作用，使顏色加深，所以染色程度不能準確反映Gus活性，Figure1a)Maturecoldstoredpotatotubers,transformedandcontrol,stainedforGUSactivity.b)Invitro-grownmicrotubers,transformedandcontrol,stainedforGUSactivityTransgenicArabidopsisstainedforGUSactivityshowingpromoteractivityoftheconstitutivepromoterCaMV35SandB)thePsMTApromoterfrompea

Patternofatao1activityvisualisedbyGUSexpressionfollowinginfectionwitheitherH.schachtiiorM.incognita.LeftTheatao1promoterdrivesGUSexpressionattheboundaryofthesymcytiumofH.schachtii(n).RightInagallinducedbyM.incognita(n)thedisruptedvasculatureshowsstrongexpressionofGUSdrivenbyatao1(gc,giantcells).Left,DownregulationofCaMV35SpromoterinthesyncytiumofHeteroderaschachtiimonitoredbyexpressionofGFP(top).BycomparisonanunifectedrootshowsregularGFPexpression(bottom).Right,ImageanalysisofthemeanredcomponentoffluorescentimagesofaGFP-transformedArabidopsisroot,viewedunderfluorescentconditions.greenbox=meangreenlevelinsidethesyncytium;bluebox=meangreenleveloutsidethesyncytium.熒光素酶基因（LUC）1986年以來，熒光素酶基因被廣泛地用作植物基因工程研究的一種新的報告基因.最常用的是來自熒火蟲的熒光素酶。分子量為60.7KD的單體蛋白質多肽，共有550個氨基酸，它編碼的基因luc已經被克??；在轉染的細胞中，熒光素酶蛋白質的半衰期比較短，其適用于做瞬時分析。熒光素酶活性測定先用去污劑處理細胞使之裂解，然后加入ATP、Mg2+離子和熒火蟲的熒光素，于是在有氧的條件下，熒光素酶會催化熒光素進行氧化反應，產生出AMP、CO2和黃-綠色的光。利用發(fā)光計對熒光素酶反應作出定量測定。氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT基因）氯霉素乙酰轉移酶的編碼基因cat，是位于大腸桿菌轉座子Tn9上的一種抗藥基因。它在真核細胞中并不存在，這一特性使其成為真核生物表達調控研究中最早使用的報告基因之一。以SB401cDNA為探針篩選馬鈴薯基因組文庫陽性克隆繪制酶切圖譜、亞克隆構建測序載體、測序、序列分析啟動子與報告基因連接、轉化，研究啟動子的特異性啟動子缺失確定活性區(qū)技術路線與其它啟動子進行活性比較花粉特異啟動子的克隆1、pGEM--7Z/SacI2、pG701/SacI3、701/SacI4、DNA/H3kb9kbpG701酶切鑒定pG701酶切電泳圖1BamHI2EcoRI3HindIII4SacI5B+S6H+S7E+S8B+E9B+H10E+H11E+B+H12pGSB/H13pGEM-7Zf(+)/S

M12345678910111213pG701酶切southern雜交1BamHI2EcoRI3HindIII4SacI5B+S6H+S7E+S8B+E9B+H10E+H11E+B+H12pGSB/H13pGEM-7Zf(+)/S12345678910111213

RestrictionenzymemapoftheinsertfragmentofpG701B--BamHIE--EcoRIH--HindIIIS--SacIX--XbaI轉基因煙草萌發(fā)花粉的GFP觀察1-14CK-光學顯微鏡CK-熒光顯微鏡轉基因煙草的冰凍切片的熒光顯微鏡觀察根葉CK-P3啟動子缺失片段與GUS相連構建雙元載體35S啟動子與GUS相連構建雙元載體(7個）LAT52啟動子與GUS相連構建雙元載體19Z啟動子與GUS相連構建雙元載體轉GUS基因煙草抗性苗轉GUS基因煙草苗及植株轉基因煙草GUS組織化學染色（1）LAT52CK-4-51-4萌發(fā)花粉的GUS組織化學染色（2）LAT52-2CK-4-9GUS基因GUGUS基因組織化學染色（3）35S-7莖橫切2-2莖橫切轉基因