標(biāo)準(zhǔn)解讀

《GB/T 36806-2018 甘蔗桿狀病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》是一項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，專門針對(duì)甘蔗桿狀病毒（Sugarcane bacilliform virus, SCBV）的檢測(cè)而設(shè)立。該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR）來(lái)定性檢測(cè)甘蔗及其繁殖材料中是否存在SCBV的方法。

首先，在準(zhǔn)備階段，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的所有試劑和設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)與驗(yàn)證，確保其處于最佳工作狀態(tài)。這包括但不限于DNA提取試劑盒、qPCR儀以及特異性引物探針的設(shè)計(jì)或選擇等。對(duì)于樣品處理，則要求采集新鮮或冷凍保存的甘蔗葉片作為檢測(cè)樣本，并按照特定步驟提取總DNA。

接著是擴(kuò)增體系構(gòu)建環(huán)節(jié)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)推薦的比例配制反應(yīng)混合液，加入適量模板DNA后進(jìn)行封閉式循環(huán)擴(kuò)增。在此過(guò)程中，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化情況可以實(shí)時(shí)跟蹤目標(biāo)序列的累積量。值得注意的是，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確性，還需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及內(nèi)參基因?qū)φ盏榷鄠€(gè)對(duì)照組別。

最后，在數(shù)據(jù)分析階段，依據(jù)Ct值（Cycle threshold value）判斷樣品是否含有SCBV：若樣品孔Ct值小于等于設(shè)定閾值且明顯低于空白對(duì)照，則判定為陽(yáng)性；反之則為陰性。此外，還應(yīng)結(jié)合電泳圖譜進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的有效性和可靠性。

該標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)室提供了統(tǒng)一規(guī)范的操作流程和技術(shù)指標(biāo)，有助于提高甘蔗桿狀病毒檢測(cè)工作的科學(xué)性與可比性，從而更好地服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的病害防控需求。


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  • 2018-09-17 頒布
  • 2019-04-01 實(shí)施
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文檔簡(jiǎn)介

ICS6502001

B16..

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T36806—2018

甘蔗桿狀病毒實(shí)時(shí)熒光

PCR檢測(cè)方法

DetectionofSugarcanebacilliformvirusbyreal-timePCR

2018-09-17發(fā)布2019-04-01實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

中華人民共和國(guó)

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

甘蔗桿狀病毒實(shí)時(shí)熒光

PCR檢測(cè)方法

GB/T36806—2018

*

中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版發(fā)行

北京市朝陽(yáng)區(qū)和平里西街甲號(hào)

2(100029)

北京市西城區(qū)三里河北街號(hào)

16(100045)

網(wǎng)址

:

服務(wù)熱線

:400-168-0010

年月第一版

20189

*

書號(hào)

:155066·1-61159

版權(quán)專有侵權(quán)必究

GB/T36806—2018

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口

(SAC/TC271)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試

:、

中心農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

、。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人高三基孫生仁吳小斌黃美婷傅華英王錦達(dá)張慧麗陳如凱

:、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T36806—2018

甘蔗桿狀病毒實(shí)時(shí)熒光

PCR檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘蔗桿狀病毒SugarcanebacilliformIMvirus和甘蔗桿狀病

IM(,SCBIMV)MO

毒SugarcanebacilliformMOvirus實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的儀器與設(shè)備試劑與材料

(,SCBMOV)PCR、、

樣品的采集與前處理檢測(cè)以及結(jié)果判斷與表述等

、。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于可能帶有和病毒的活體寄主植物的快速檢測(cè)診斷

SCBIMVSCBMOV、。

2縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

。

十六烷基三甲基溴化銨

CTAB:(cetyltrimethylammoniumbromide)

值實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:PCR,(cycle

threshold)

脫氧核糖核酸酶

DNase:(deoxyribonuclease)

乙二胺四乙酸二鈉

EDTA-Na2:(edetatedisodium)

羧基熒光素

FAM:6-(6-carboxy-fluorescein)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR:(polymerasechainreaction)

核糖核酸酶

RNase:(ribonuclease)

逆轉(zhuǎn)錄酶核糖核酸酶

RT/RNaseH:/H(reversetranscriptase/RNaseH)

甘蔗桿狀病毒SugarcanebacilliformIMvirus

SCBIMV:IM()

甘蔗桿狀病毒SugarcanebacilliformMOvirus

SCBMOV:MO()

甘蔗桿狀病毒Sugarcanebacilliformvirus

SCBV:()

羧基四甲基羅丹明

TAMRA:6-(6-carboxytetramethylrhodamine)

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽

Tris-HCl:[Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride]

3甘蔗桿狀病毒基本信息

甘蔗桿狀病毒屬于花椰菜花葉病毒科Caulimiviridae桿狀病毒屬Badnavirus英文名

()DNA(),

稱為Sugarcanebacilliformvirus縮寫為國(guó)際病毒分類委員會(huì)于年將的

,SCBV。(ICTV)2012SCBV

個(gè)分離物正式定為甘蔗桿狀病毒SugarcanebacilliformIMvirus和甘蔗桿狀病

2IM(,SCBIMV)MO

毒SugarcanebacilliformMOvirus兩個(gè)不同的種甘蔗桿狀病毒其他信息參見(jiàn)附錄

(,SCBMOV)。A。

4方法原理

在比對(duì)甘蔗桿狀病毒基因組序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一對(duì)僅在該病毒基因間保守的特異

,RT/RNaseH

性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針在實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)中探針的熒光

TaqMan。PCR,TaqMan

信號(hào)強(qiáng)度伴隨著目標(biāo)序列

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