原料預(yù)處理技術(shù)

模塊二：相關(guān)的分離純化技術(shù)

子模塊一：原料的預(yù)處理技術(shù)復(fù)習(xí)提問簡述糖酵解的意義？1mol葡萄糖徹底氧化生成多少ATP？新課導(dǎo)入我們?nèi)绾螐纳矬w中提取出生物活性大分子？生物技術(shù)下游加工過程的一般流程和單元操作培養(yǎng)液（發(fā)酵液）的預(yù)處理和固液分離；初步純化（提?。?；高度純化（精制）；成品加工。一般下游加工過程可分為4個(gè)階段

下游加工過程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞外產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。影響其純化的因素是什么？影響發(fā)酵液后處理的主要因素粘度,雜蛋白影響樹脂對產(chǎn)物的吸附能力；在萃取操作中，易產(chǎn)生乳化，不利于兩相的分離；污染濾膜，降低濾速高價(jià)無機(jī)離子當(dāng)采用離子交換法提取產(chǎn)物時(shí)，影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量降低發(fā)酵液粘度去除雜蛋白目的不僅在于分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒（細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物），還希望除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過濾。發(fā)酵液的預(yù)處理一、發(fā)酵液過濾特性的改變微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。微生物發(fā)酵液的成分極為復(fù)雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法：調(diào)酸（等電點(diǎn)）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度

2.調(diào)整pH3.凝聚與絮凝

根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時(shí)間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。氨基酸、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的調(diào)節(jié)；在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。凝聚——指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象；絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。陽離子對帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚

發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。

絮凝定義：是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使細(xì)胞聚集形成粗大的絮凝團(tuán)的過程。1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑有機(jī)合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計(jì)量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應(yīng)用醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機(jī)高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機(jī)高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。聚丙烯酰胺絮凝劑對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。（3）混凝4.加入助濾劑5.加入反應(yīng)劑

一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土?xí)r，通常細(xì)粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價(jià)無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白在采用離子交換提煉時(shí)，會(huì)影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。在采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低其交換容量和吸附能力，在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。在常規(guī)過濾或膜過濾時(shí)，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。

因此，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。二、發(fā)酵液的相對純化（一）、高價(jià)無機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀（二）雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負(fù)電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。1.沉淀法在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu++、Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。A.酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。2.變性法

加熱，大幅度調(diào)節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法重力沉降浮選旋液分離介質(zhì)過濾離心通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的分離，污水處理懸浮液以較高速度沿切線方向進(jìn)入旋風(fēng)分離器，輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。工業(yè)上常用霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法；細(xì)菌和酵母菌為單細(xì)胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心分離，如對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，也可用過濾進(jìn)行固液分離。二、固液分離的方法優(yōu)點(diǎn)：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。離心機(jī)種類：碟片式離心機(jī)、管式離心機(jī)、傾析式離心機(jī)。1.離心分離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達(dá)到液－液、液－固、液－液－固分離的方法，統(tǒng)稱為離心分離。離心分離因數(shù)f=Gu2gRGgR(2πRn)260GRn2900===GDn21800重量kg旋轉(zhuǎn)直徑轉(zhuǎn)速r/min微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。2.過濾A.根據(jù)過濾機(jī)理，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾。澄清過濾：濾餅過濾：過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，當(dāng)懸浮液通過濾層時(shí)，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當(dāng)懸浮液通過濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當(dāng)濾餅至一定厚度時(shí)即起過濾作用，此時(shí)即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾，在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。B.常用過濾設(shè)備（1）板框壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)格低，動(dòng)力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)。缺點(diǎn)不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時(shí)間較長。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。單元組成板布板布板操作注意點(diǎn)盡量使工作時(shí)間和輔助時(shí)間接近；降低濾液粘度（2）真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)（3）硅藻土過濾機(jī)（3）硅藻土過濾機(jī)1）切向流過濾（Cross-FlowFiltration）又稱錯(cuò)流過濾

交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。2）雙水相萃取

向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度