選修課基因治療

基因診斷與基因治療基因診斷2023/2/5232023/2/5第一節(jié)基因診斷的基本概念第二節(jié)基因診斷的基本方式和方法第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用42023/2/5第一節(jié)基因診斷的基本概念一、分子診斷與基因診斷二、基因診斷的基本流程52023/2/5分子診斷一、分子診斷與基因診斷

用分子生物學(xué)技術(shù)對生物體的DNA序列及其產(chǎn)物（RNA和蛋白質(zhì)）進行定性、定量分析，為疾病診斷提供依據(jù)（moleculardiagnosis）62023/2/5基因診斷定義（genediagnosis）

針對DNA和/或mRNA的分子診斷，通過分析這些遺傳信息分子的序列，從而在分子水平上確定疾病的病因，具高度特異性基因診斷的前提已明確疾病表型與基因型的關(guān)系72023/2/5基因診斷的內(nèi)容檢測個體的基因序列的特征基因突變分析測定基因的拷貝數(shù)基因表達產(chǎn)物分析檢測是否存在外源基因82023/2/5基因診斷的基本技術(shù)流程92023/2/5第二節(jié)基因診斷的基本方式和方法一、對疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析二、對疾病致病基因結(jié)構(gòu)異常的直接診斷102023/2/5一、對疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析連鎖分析（linkageanalysis）利用與致病基因相連的某些基因，作為遺傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在而判斷個體是否帶有致病基因優(yōu)點

無需更多了解致病基因結(jié)構(gòu)及其分子機制缺點

沒有直接檢測致病基因突變，是間接診斷112023/2/51.連鎖分析的遺傳標(biāo)志特點●不同個體之間存在高度的多態(tài)性

●需要獲得足夠數(shù)量的家系成員樣本

●標(biāo)記基因與致病基因相連鎖122023/2/5連鎖遺傳標(biāo)志的類型單核苷酸變異短串聯(lián)重復(fù)序列變異

目前可用于基因診斷的連鎖遺傳標(biāo)志主要包括兩種形式的DNA變異132023/2/5

在人類基因組中，大約平均200～500bp就可發(fā)生一次變異。這些變異使個體之間廣泛存在著DNA單核苷酸序列的差異單核苷酸變異142023/2/5可檢測的單核苷酸變異的遺傳標(biāo)志限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

152023/2/5限制性片段長度的多態(tài)性指DNA序列上發(fā)生一個變異后獲得或丟失了一限制性識別位點，使DNA限制性片段長度發(fā)生變化，在人群中形成兩種或兩種以上的限制性類型利用特定限制性識別位點進行基因分析單核苷酸變異162023/2/5單核苷酸多態(tài)性

（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不小于1%SNP可以確定個體的疾病易感性和藥物反應(yīng)性單核苷酸變異172023/2/5短串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列基因組中某種核心序列彼此連接重復(fù)排列而成的特殊序列短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat，STR）

在串聯(lián)重復(fù)序列中的一種2～4bp的重復(fù)單位182023/2/5●在人類基因組中分布廣泛，總數(shù)大約有5～10萬個●個體之間的STR都是互不相同的●能夠穩(wěn)定地遺傳短串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點192023/2/52.連鎖分析的主要方法

RFLP連鎖分析

基于STR的微衛(wèi)星分析

基于SNP的單倍型分析202023/2/5二、對疾病致病基因結(jié)構(gòu)異常的直接診斷1.基因缺失或插入的診斷2.點突變的診斷3.STR序列的診斷212023/2/5Southern印跡法跨越斷裂點的PCR（又稱裂口PCR，gap-PCR）1.基因缺失或插入的診斷222023/2/52.點突變的診斷等位基因特異性寡核苷酸分子雜交

（allelespecificoligonucleotide，ASO）

反向點雜交

（reversedotblot，RDB）變性高效液相色譜（denaturehighperformanceliquidchromatography，DHPLC）

被測點突變的確切位置及其基因序列已經(jīng)清楚前提條件主要方法232023/2/5反向點雜交（reversedotblot，RDB）

將針對各種突變和正常序列的ASO探針固定在雜交膜上，而將原來在ASO雜交體系中固定在膜上的PCR產(chǎn)物改為液相進行雜交，這種方法稱為RDB。是改進的ASO技術(shù)

242023/2/5變性高效液相色譜

利用PCR擴增過程的單鏈DNA產(chǎn)物可以隨機與互補鏈相結(jié)合而形成雙鏈的特性，依據(jù)最終產(chǎn)物中是否會出現(xiàn)異源雙鏈來判斷待測樣品中是否存在點突變252023/2/53.STR序列的診斷

可用PCR直接擴增技術(shù)來診斷基于STR的DNA片段長度多態(tài)性STR:短串聯(lián)重復(fù)序列262023/2/5第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用一、輔助遺傳病的臨床診斷二、疾病易感性及患病風(fēng)險預(yù)測三、療效評價及用藥指導(dǎo)四、其他應(yīng)用272023/2/5一、輔助遺傳病的臨床診斷我國前能開展的基因診斷

單基因遺傳病的基因診斷以淘汰重型患兒為目的的產(chǎn)前診斷

282023/2/5二、疾病易感性及患病風(fēng)險預(yù)測1.遺傳病患病風(fēng)險分析2.其他疾病易感性預(yù)測性診斷292023/2/51.遺傳病患病風(fēng)險分析產(chǎn)前診斷植入前遺傳學(xué)診斷遺傳篩查302023/2/5產(chǎn)前診斷

分析胎兒的某些特定基因以診斷人類染色體病和單基因遺傳病312023/2/5

指對配子或移入宮腔之前的胚胎進行快速的遺傳學(xué)分析，篩選出健康配子或胚胎，以避免異常妊娠的一項技術(shù)植入前遺傳學(xué)診斷322023/2/5遺傳篩查

指針對特定人群的系統(tǒng)檢查，以期獲得被檢測群體中的個體是否擁有某一特定疾病的基因型，從而為被檢對象或其子女提供疾病易感性、患病風(fēng)險的相關(guān)信息332023/2/52.其他疾病易感性預(yù)測性診斷腫瘤與癌基因抑癌基因

在一些有明顯遺傳傾向的腫瘤中，這二類基因的突變與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系例：

視網(wǎng)膜母細胞瘤與RB基因

Li-Fraumeni綜合征與p53基因乳腺癌與BRCA-1基因?qū)@些基因的突變分析對于疾病診斷和預(yù)測腫瘤發(fā)生風(fēng)險有一定的參考價值342023/2/5三、療效評價及用藥指導(dǎo)

遺傳診斷可應(yīng)用于臨床藥物療效的評價及提供指導(dǎo)用藥的信息352023/2/5四、其他應(yīng)用1.法醫(yī)學(xué)2.病原體的基因診斷362023/2/5

1.法醫(yī)學(xué)DNA指紋鑒定技術(shù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)是DNA的多態(tài)性DNA指紋圖譜分析372023/2/52.病原體的基因診斷

針對病原體自身特異性核酸（DNA或RNA）序列進行的診斷分子雜交基因擴增方法優(yōu)點應(yīng)用范圍廣泛簡便快速、成本低特異、敏感、便于定量基因治療2023/2/538基因治療

概念基因治療：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的?；虔煼ㄊ侵笇⑼庠凑；?qū)氚屑毎?，通過替代異?；?、封閉致病基因、剪去致病基因、修復(fù)受損基因和重建基因調(diào)控系統(tǒng)等，以糾正或補償因基因缺陷和異常所引起的疾病，從而達到治療的目的

全世界已獲準(zhǔn)的基因治療臨床試驗方案達一千多項，其中，66%是針對癌癥的治療二、基因治療的必要條件發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作三.基因治療方式直接基因治療和間接基因治療直接基因治療(致病基因的原位置換)：糾正突變基因

在原位修復(fù)缺陷的基因，以達到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）基因敲出技術(shù)（geneknockout)

是指通過基因同源重組的過程定向的在活細胞中從基因組上移出特定基因的過程，從而建立基因剔除細胞和基因剔除生物

2、間接基因治療：

導(dǎo)入外源正?；颍嬗腥毕莸幕?。而對靶細胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。直接抑制有害基因的表達基因增補：將目的基因?qū)氩∽兗毎⒃诩毎麅?nèi)表達，不需將缺陷基因替換出來，只要目的基因在細胞中能夠表達，就達到了治療的目的。這是目前基因治療大多采用的方法，對單拷貝基因遺傳病有效。如血友病?；蚋深A(yù)(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的?；蚋深A(yù)基因干預(yù)的種類：反義RNA：封閉基因表達核酶：裂解特異的靶mRNARNA干涉技術(shù)：

反義RNA(antisenseRNA):是指與mRNA互補的RNA分子,通常由15-20個核苷酸組成。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達。兩種機制:1.反義寡聚核苷酸可以激活RNaseH，該酶可以切割DNA·RNA雜合分子中的RNA鏈，導(dǎo)致靶mRNA降解2.反義寡聚核苷酸可以通過空間位阻效應(yīng)阻止核糖體結(jié)合來抑制靶mRNA的翻譯靶RNA上的結(jié)合位點必須是暴露的反義試劑必須被保護起來免遭核酸酶攻擊必須保證反義試劑能夠被細胞攝取并在胞內(nèi)正確定位需克服技術(shù)問題:

2001，2002連續(xù)兩年被美國《Science》雜志評選為年度10大突破技術(shù)RNA干涉RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。

2006年10月2日，現(xiàn)年47歲的AndrewZ.Fire和45歲的CraigC.Mello由于在基因沉默現(xiàn)象研究領(lǐng)域的杰出貢獻而獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。

RNA干涉機制:螺旋酶、RNA依賴的RNA聚合酶）,可以切割雙鏈RNA，雙鏈RNA再與Dicer形成沉默復(fù)合物(RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干涉的過程。

2個步驟：（1）長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶(Dicer)切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA）（2）小干擾性RNA與細胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），該復(fù)合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷

目前RNA干擾技術(shù)主要應(yīng)用于探查基因功能和探索治療腫瘤或感染性疾病的可能性.初步的實驗結(jié)果提示RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虻娜四[瘤。用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應(yīng)性。

將RNA干擾技術(shù)用于臨床治療人類疾病還有許多研究工作要做，如何將小干擾性RNA或能在細胞內(nèi)生成小干擾性RNA樣轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)粒DNA或病毒載體安全、有效地導(dǎo)入靶組織或靶細胞就是一個必須解決的問題。RNA干擾技術(shù)用于治療人類疾病的安全性仍是個未知數(shù)。四、基因治療的基本程序

目的基因的選擇與獲得載體的選擇將目的基因克隆到載體基因表達的檢測治療效果的體外研究建立動物模型治療效果的體內(nèi)研究藥代及藥理毒理研究中試研究申報及進行臨床試驗擴大規(guī)模進行試生產(chǎn)(一)、目的基因的選擇：1.能改變腫瘤細胞的惡性表型的基因

腫瘤細胞主要有癌基因的突變、擴增、過度表達，對此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正?；蜃鳛橹委熁?，用正常基因剔除或替換缺陷基因。

2.能提高腫瘤細胞的免疫原性的基因

向腫瘤細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細胞免疫的細胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增強宿主的抗癌免疫反應(yīng)，可統(tǒng)稱為免疫基因治療。

3.腫瘤藥物增敏基因

腫瘤藥物敏感基因治療是將編碼某一敏感性因子的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，使腫瘤細胞對某種原本無毒或低毒的藥物產(chǎn)生特異的敏感性而死亡。這一表達敏感性因子的基因也被稱為自殺基因.常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因

,該基因能將無細胞毒性的原藥丙氧鳥苷（GCV）磷酸化，對細胞產(chǎn)生毒性作用理想的治療基因還必須：基因可有效導(dǎo)入靶細胞基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定存留導(dǎo)入基因能適量表達導(dǎo)入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害(二)基因載體的選擇

有病毒載體有非病毒體兩類，多用病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體。常用病毒載體的比較

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體腺相關(guān)病毒載體載體大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸類型RNADNADNA外源基因容量＜7kb2～7kb＜3.5kb(小)靶細胞要求分裂細胞；

表面須有特殊受體分裂或非分裂細胞分裂或非分裂細胞基因整合隨機整合不整合定點整合于19號染色體長臂外源基因表達情況瞬時表達/穩(wěn)定表達瞬時表達穩(wěn)定表達基因轉(zhuǎn)染效率高高不明(三)選擇基因治療的靶細胞體細胞：目前基因治療的現(xiàn)狀僅限于體細胞。基因型的改變只限于患者本人，不會遺傳到下代。生殖細胞：理論上這是基因治療的重點，對生殖細胞中缺陷基因的糾正，不僅使患者本人（當(dāng)代）的缺陷得以更正，而且能將正常基因遺傳到下代，是一種徹底根治缺陷的方法。但是由于風(fēng)險大，問題復(fù)雜，至今仍未有人敢實驗。1、發(fā)病的器官及位置2、容易取出和植入3、容易在體外培養(yǎng)4、容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)5、壽命較長基因治療中體細胞的選擇免疫細胞

外周血淋巴細胞是惡性腫瘤、獲得性及遺傳性免疫系統(tǒng)紊亂性徉病的基因治療的主要靶細胞。主要以T淋巴細胞為主成纖維細胞

成纖維細胞位于全身并具有較強的自我更新能力。優(yōu)點有：①易于獲得；②容易體外培養(yǎng)和擴增；③分裂中的成纖維細胞易與逆轉(zhuǎn)錄病毒一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能較穩(wěn)定的表達外源目的基因；④攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內(nèi)并進行表達；⑤回植的成纖維細胞容易取出，等。主要缺點是在體內(nèi)由于細胞凋亡而引起的基因表達失活。骨骼肌細胞

易于獲得及在體個可大量擴增，可用于治療累及肌肉的遺傳病及一旦插入分泌性基因可使基因產(chǎn)物直接分泌進入血液等。

血管平滑肌細胞

血管平滑肌細胞易于獲得、培養(yǎng)和移植，故是基因治療常用的靶細胞。造血干細胞

造血干細胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細胞。在腫瘤基因治療中，造血干細胞是耐藥基因、細胞因子基因等較理想的受體細胞。

(四)基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用物理、化學(xué)或生物學(xué)等技術(shù)和方法將外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）轉(zhuǎn)移到受體菌或者細胞內(nèi)，并在細菌或細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴增和表達，稱為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。1、非病毒導(dǎo)入法：直接注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、陽離子多聚體2、病毒載體導(dǎo)入法遺傳病的基因治療研究1990.9.14首例基因治療4歲女孩