第八章基因工程

第八章基因工程第一節(jié)基因工程概述

遺傳工程廣義：細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程、酶工程、發(fā)酵工程狹義：基因工程

→基因工程概述基因工程是20世紀(jì)70年代初隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的一門新技術(shù)。

→1982年經(jīng)美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)，采用基因工程方法在細(xì)菌中表達(dá)生產(chǎn)的人的胰島素進(jìn)入市場，成為基因工程產(chǎn)品直接造福于人類的首例?！?985年轉(zhuǎn)基因植物獲得成功?！?996年克隆羊誕生?！F(xiàn)在，人類已利用這一技術(shù)改造和創(chuàng)建新的生命形態(tài)、生產(chǎn)藥品、疫苗和食品，診斷和治療遺傳疾病。

基因工程的基本步驟：1.目的基因的分離或合成。2.將目的基因與載體DNA連接，構(gòu)建重組DNA

分子-表達(dá)載體。3.將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并獲得具有外源基因的個體。4.轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定。5.轉(zhuǎn)基因生物的安全性評價。第二節(jié)基因的分離基因分離（克隆）包括3個步驟：1.目標(biāo)DNA片段（基因）的分離；2.目標(biāo)基因克隆到載體上；3.載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中大量復(fù)制。一、工具酶1、限制性內(nèi)切核酸酶

限制酶：作用于特定（異）核苷酸序列的磷酸二脂酶。Ⅰ型酶：僅EcoB和EcoK兩種，催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能。Ⅱ型酶：基因工程中應(yīng)用最廣泛。Ⅲ型酶：具有特異的識別位點(diǎn)，識別位點(diǎn)是

非對稱的。

Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特異識別和切割的序列部位；②DNA分子上兩個單鏈斷裂的部位通常不是直接相對的；③斷裂所形成的DNA片段常具有堿基互補(bǔ)的單鏈尾巴（粘性末端）；限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物連接

回紋序列圖12-1通過用相同的限制性內(nèi)切酶切割形成一個重組DNA分子

限制性內(nèi)切酶SmaI的識別及酶切位點(diǎn)平齊末端2、DNA連接酶

DNA連接酶：重組DNA分子構(gòu)建必不可少的工具酶，能催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來。3、反轉(zhuǎn)錄酶

一類以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，故又稱依賴于RNA的DNA聚合酶。4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR是體外快速擴(kuò)增DNA的方法,由美國的Mullis(1986)發(fā)明,1993年諾貝爾化學(xué)獎。PCR可對特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，且可用痕量DNA作模板，對DNA純度要求也不高,可在幾小時內(nèi)使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬個拷貝。PCR反應(yīng)從啟動到結(jié)束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：1）變性：95℃，DNA

雙鏈分離成單鏈。2）退火(復(fù)性)：55℃

左右，引物與單鏈的模板DNA序列互補(bǔ)結(jié)合。3）延伸：72℃左右，Taq酶通過在引物的3’-OH端增加堿基的辦法使引物延伸。表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824二、載體

載體：將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。載體類型：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒、細(xì)菌/酵母菌人工染色體BAC、YAC等。載體特點(diǎn)：①在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立復(fù)制，即本身為復(fù)制子，有獨(dú)立的復(fù)制起始位點(diǎn)。②有限制酶切位點(diǎn)，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增。③有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細(xì)胞。④分子量小，多拷貝，易于操作。⑤載荷外源DNA的大小范圍要寬，安全。

（1）細(xì)菌質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用于基因工程圖12-6質(zhì)粒pUC18的結(jié)構(gòu)及多克隆位點(diǎn)

（2）噬菌體載體1、噬菌體；

2、噬菌體DNA；

3、噬菌體DNA中間基因簇；4、將連接物體外包裝后感染細(xì)菌，制備基因庫（用于基因庫構(gòu)建）（3）克隆大片段DNA的載體

黏粒載體：含有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒載體，兼有λ噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點(diǎn)?？寺⊥庠雌蔚拈L度在15-45kb之間。細(xì)菌人工染色體（BAC）上述的幾種載體都不能攜帶大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因長度在50kb以上。細(xì)菌人工染色體載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計構(gòu)建的基于F因子的人工載體。圖12-9細(xì)菌人工染色體載體pBAC108L及其多克隆位點(diǎn)?？刹迦脒_(dá)300kb左右的DNA片段。酵母人工染色體（YAC）YAC載體是基于酵母染色體結(jié)構(gòu)設(shè)計的，可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成為人類基因組計劃（HGP）的一種重要工具。三、基因分離方法一個基因就是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段。包括：啟動子、終止子、內(nèi)含子等。1、基于文庫的基因分離方法基因文庫(library)：是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因文庫中分離基因的流程為：（1）構(gòu)建基因文庫

基因組文庫：使用與切割質(zhì)粒相同的限制性內(nèi)切酶，將供體生物體的基因組DNA切成許多片段，然后將其連接到載體上構(gòu)成的一個重組DNA群體cDNA文庫：以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNA，將其與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增構(gòu)建成的基因庫。（2）篩選基因庫

利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫。

圖12-10菌落雜交技術(shù)

（3）陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進(jìn)一步分析、鑒定，才能得到目的基因序列測定、生物信息分析、功能預(yù)測、功能鑒定。2、T-DNA標(biāo)簽克隆基因

利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲取目標(biāo)基因或克隆。T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體

產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA利用側(cè)翼DNA序列作探針從cDNA文庫中釣取基因

基因功能的驗(yàn)證（遺傳互補(bǔ)測驗(yàn)，分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能）圖12-11T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本原理

3、基于PCR的基因克隆

原理：根據(jù)待擴(kuò)增基因的序列合成引物，使兩個引物序列之間的基因序列獲得大量擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的基因拷貝用于研究。

4、基因的人工合成對于已知核苷酸序列、分子量較小的基因可以通過化學(xué)合成法制備基因。一般先一段一段地合成，然后將這些小片段連接起來。人工合成基因可以由DNA自動合成儀來完成。第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入一、重組DNA技術(shù)重組DNA：指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種

DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。重組DNA技術(shù)主要步驟：1)從細(xì)胞或組織獲得DNA并純化；2)用限制酶切割DNA；3)將所得限制片段連接到載體上,形成重組DNA分子；4)重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子--克隆。5)克隆的DNA分子可以從宿主細(xì)胞中回收，純化；6)克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)。重組DNA分子二、植物遺傳轉(zhuǎn)化方法1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（1）根癌農(nóng)桿菌(Ti質(zhì)粒)（2）發(fā)根農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)

Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒包括五個區(qū)域：LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)；3.冠癭堿代謝區(qū)；4.復(fù)制原點(diǎn)；5.毒性區(qū)(Vir)?！鶷-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組?！鶹ir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。Ti質(zhì)粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及α-互補(bǔ)顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)

圖12-15棉花轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)過程F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體2、基因槍法基因槍法\生物彈法\微粒槍法\微粒轟擊法—金、鎢依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：無宿主限制，可以對任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究第四節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定

一、分子檢測PCR：假陽性與假陰性

Southernblot：轉(zhuǎn)基因的完整性和拷貝數(shù)Northernblot：mRNAWesternblot：蛋白質(zhì)二、性狀鑒定M12

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789第五節(jié)基因工程的應(yīng)用及安全性評價一、基因工程的應(yīng)用1、轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆的優(yōu)良品系或品種，很多已經(jīng)大面積種植推廣。2008年1.25億公頃：大豆、玉米、棉花、水稻、馬鈴薯、番茄等2、轉(zhuǎn)基因動物：羊、牛

3、基因工程工業(yè)

生產(chǎn)胰島素等

在細(xì)菌中產(chǎn)生胰島素的方法4、遺傳疾病診斷RFLP法（鐮刀性貧血?。?/p>

5、基因治療

利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系骄哂羞z傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病?；蛑委煹妮d體和重組DNA分子

6、環(huán)境保護(hù)生物修復(fù)，指利用生物吸收、降解、轉(zhuǎn)化環(huán)境中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化