第六章 分光光度技術(shù)

第三章分光光度技術(shù)分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的技術(shù)。第一節(jié)光學(xué)原理把電磁波按頻率大小，從頻率最小的無線電波到頻率最大的γ射線排列，既為電磁波的波譜電磁波譜當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時，透過光的強度會減弱。因為它分成了三部分：一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，其余便是透過光的強度。即：入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光

“空白”校正：在檢測過程中，若用蒸餾水或待測溶液的溶劑作為“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的損失，則：入射光(I。)=吸收光+透過光(I)分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的技術(shù)。吸收光譜（absorptionspectrum）即物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同而產(chǎn)生的光譜。分子對各個波長的光吸收程度不同，這是分子的結(jié)構(gòu)特性所決定的。物質(zhì)所發(fā)射的光是具有波粒二象性：

微粒性

波動性E為光子的能量；ν為光波的頻率（Hz）；h為普朗克常數(shù)（6.626）；c為光速（2.9977×108m／s）；λ為光波的波長

光波具有一定的頻率。不同單色光的顏色不同，即因其頻率不同所致。不同頻率的光波在真空中的傳播速度相同。根據(jù)光的速度(c)和頻率(v)可計算出它的波長(入

)S2S1S0S3E2E0E1E3h物質(zhì)的吸收光譜:在連續(xù)光譜中某些波長的光被物質(zhì)吸收后產(chǎn)生的光譜被稱作吸收光譜,包括分子吸收光譜和原子吸收光譜。吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。從一個有連續(xù)光譜的光源，逐步地分出各個波長的光，使其透過待測物的真溶液，測出其在不同波長時的光密度；然后以波長為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，就可以得到待測物的吸收光譜曲線；由此找出其中吸收最強的波長，作為靈敏光波長對該物質(zhì)未知液液進行定量測定。曲線1-細菌葉綠素a；曲線2-葉綠素a；曲線3-葉綠素b；曲線4-藻膽紅素；曲線5-β-類胡蘿卜素朗伯-比爾定律：

I0：入射光強度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數(shù)bI0I朗伯-比爾定律的適用條件：

1.入射光為單色光。波長范圍越大，單色光純度越低，偏離越大；

2.溶液中鄰近分子的存在并不改變每一給定分子的特性，即分子間互不干擾。

3.適用于分子吸收和原子吸收。光譜分析技術(shù)的分類

分子吸收法:可見與紫外分光光度法、紅外光譜法分子光譜

分子發(fā)射法:分子熒光光度法光譜技術(shù)原子吸收法：原子吸收法原子光譜原子發(fā)射法：發(fā)射光譜分析法、原子熒光法等

第二節(jié)紫外-可見分光光度計

分光光度計:能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的儀器。分析精密度高測量范圍廣分析速度快樣品用量少射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光根據(jù)使用的波長范圍不同分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計等。紫外-可見分光光度計：工作波段在200nm～800nm的分光光度計。其中：200nm～400nm為紫外光區(qū)。400nm～800nm為可見光區(qū)。屬于分子吸收光譜儀。721可見分光光度計

722系列可見分光光度計

SP-756P紫外可見分光光度計TENSOR系列紅外光譜儀

0.208光源單色器吸收池檢測器顯示系統(tǒng)一、紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)示意圖

它包括5個基本部件：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表光源（lightsource）：提供入射光的裝置。要求:1.能在所需波長范圍的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜；

2.有足夠的輻射強度并能長時間穩(wěn)定。常用的光源有熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等。幾種常見光源比較光源波長范圍(nm)

特點鎢燈320~2500鎢絲易蒸發(fā)，壽命短。用于可見光區(qū)鹵鎢燈320~2500加入鹵素使用壽命延長，穩(wěn)定性好氫燈185~375用于紫外區(qū)氘燈185~375發(fā)光強度比氫燈高3～5倍汞燈254~734用于紫外或熒光分析儀單色器（Monochromator）：是將來自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置。入射狹縫：限制雜散光進入；色散元件：將復(fù)合光分解為單色光，有棱鏡和光柵兩種；準(zhǔn)直鏡：將來自色散元件的平行光束聚集在出射狹縫上；出射狹縫：將固定波長范圍的光射出單色器，可以限制通帶寬度。吸收池（absorptioncell）：是用來盛放被測溶液的器件。在可見光區(qū)常用無色光學(xué)玻璃或塑料制作；在低于350nm的紫外區(qū)需用能透紫外線的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射應(yīng)嚴(yán)格保持一致。指紋、油污及池壁上的沉淀物都會影響吸收池的透光性能。微型吸收池（Microdrillabsorptioncell）：“光程/體積比”提高了近10倍。多光路吸收池（Multipie-pathabsorptioncell）：在吸收池壁上裝有反射鏡，使光線在溶液中經(jīng)多次反射后才離開吸收池，大大增加了有效光程，提高了測定的靈敏度。通過改進吸收池的幾何形狀，可提高“光程/體積比”，即盡可能延長單位體積的光程。常用的有：檢測器：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號的裝置。對檢測器的要求：

1、產(chǎn)生的電信號與照射到它上面的光強有恒定的函數(shù)關(guān)系；

2、波長響應(yīng)范圍大；

3、靈敏度高；

4、響應(yīng)速度快，一般要求小于10-8s；

5、產(chǎn)生的電信號易于檢測、放大，噪聲低。檢測器工作原理

光照射在某些金屬表面，會有光電子從金屬表面逸出，這種光電效應(yīng)稱為外光電效應(yīng)。利用外光電效應(yīng)可以制成光電管和光電倍增管。光深入到物體內(nèi)部，將物體內(nèi)部原子中的一部分束縛電子激發(fā)成自由電子，但這些電子并不逸出物體，而是留在物體內(nèi)部從而使物體導(dǎo)電性增強，稱為內(nèi)光電效應(yīng)。利用內(nèi)光電效應(yīng)可制成光敏電阻、光敏二極管以及光電池。幾種常用檢測器比較檢測器

工作原理

特點光電管外光電效應(yīng)簡單,靈敏度低光電倍增管外光電效應(yīng)與多級二次發(fā)射體相結(jié)合靈敏度比光電管高200多倍光電二極管陣列外光電效應(yīng)，由一行光敏區(qū)和二行讀出寄存器構(gòu)成可同時檢測多個波長的光強度。壽命長、光譜響應(yīng)范圍寬、可靠性高、讀出速度快光電池內(nèi)光電效應(yīng)結(jié)實、便宜、使用方便。但產(chǎn)生的電流大小不穩(wěn)定電荷耦合器件模擬集成電路芯片能同時多譜線檢測，極大地提高分析速度第三節(jié)分光光度技術(shù)的應(yīng)用

一、測定溶液中物質(zhì)的含量可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中物質(zhì)的含量。比色法：這需要測定標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度待測定的溶液)的吸光度，將兩者進行比較。由于所用吸收池的厚度是一樣的，可用下式進行計算。

Ax/As=KCxL/KCsL，即：Cx=Ax×Cs/As式中Cx代表未知液的濃度，Cs代表標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，Ax和As分別代表未知液和標(biāo)準(zhǔn)液所測得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計算得之。分光度法：可以先測出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線.然后測定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對應(yīng)的濃度。含量測定時所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，這樣做有兩個好處：①靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；②可以避免其他物質(zhì)的干擾。

二、用紫外光譜鑒定化合物

使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度—波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質(zhì)種類的鑒定當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀一樣時，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時，其吸收光譜曲線中峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低谷的波長是一定不變的。

紫外光吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。紫外光吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外光吸收光譜不能決定一個未知物的結(jié)構(gòu)，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。第四節(jié)分光光度法的誤差

在分光光度法中，即使將各種因素都控制好，對于濃度過大或過小的樣品，誤差仍然很大。濃度過大的樣品，其吸光度過高，影響檢測器的靈敏度，且讀數(shù)標(biāo)尺刻度的精度差，誤差亦大，故難于準(zhǔn)確。濃度過低的樣品，其吸光度小，則因與儀器本身因素有關(guān)，也容易引起檢測器標(biāo)尺上的讀數(shù)誤差。例如光源波動的影響：當(dāng)光源強度改變1％、吸光度為1.0時，只有0.4％的誤差，但在吸光度為O.045時，則可產(chǎn)生9.6％的誤差。實際上，在整個透光度(或吸光度)范圍的不同部分均有不同的誤差。從理論上推算，相對誤差的最小的部分在透光度為36.8％處(或吸光度為O.4343處)故通常認(rèn)為測定值在吸光度0.20～0.80范圍內(nèi)(透光度為20％～65％)誤差較小，超出此范圍，相對誤差均會增大?！咀⒁馐马棥?.儀器須安放在穩(wěn)固的工作臺上，不能隨意搬動。嚴(yán)防震動，潮濕和強光直射。2.盛裝比色液時，約達比色皿2/3體積，不宜過多或過少。若不慎使溶液流至比色皿外面須用棉花或拭鏡紙擦干，才能放入比色架。拉比色桿時要輕，以防溶液濺出，腐蝕機械。3.千萬不可用手或濾紙等物摩擦比色皿的透光面。4.比色皿用后應(yīng)立即用自來水沖洗干凈，若不能洗凈，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鮮配制的重鉻酸鉀洗液短時間浸泡，然后用水沖洗干凈，倒置晾干。5.每套分光光度計上的比色皿和比色皿架不得隨意更換。6.試管或試劑不得放置于儀器上，以防試劑濺出腐蝕機殼。7.如果試劑濺在儀器上，應(yīng)立即用棉花或紗布擦干。8.測定溶液濃度的光密度值宜在0.1—0.7之間最符合光吸收定律，線性好，讀數(shù)誤差較小。如光密度超過0.1—1.0范圍，可調(diào)節(jié)比色液濃度，適當(dāng)稀釋或加濃，再進行比色。9.合上檢測室蓋連續(xù)工作的時間不宜過長，以防光電管疲乏。每次讀完比色架內(nèi)的一組讀數(shù)后，立即打開檢測室蓋。10.儀器連續(xù)使用不應(yīng)超過2小時，必要時間歇半小時再用。11.測定未知液時，先作該溶液的