礦化膠原涂層作為生物涂層材料的可行性,醫(yī)學(xué)工程論文

礦化膠原涂層作為生物涂層材料的可行性,醫(yī)學(xué)工程論文20世紀(jì)60年代，自從來自瑞典的生理學(xué)家Brǎnemark教授發(fā)現(xiàn)鈦金屬與兔子胚骨的牢固結(jié)合以來，鈦金屬就因其良好的力學(xué)性能、生物相容性及耐腐蝕性能等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于骨科及口腔外科[1].但是，鈦金屬本身是一種生物惰性材料，需要對(duì)其進(jìn)行外表改性，使其變成活性外表才能進(jìn)一步促進(jìn)鈦金屬作為種植體的應(yīng)用前景。當(dāng)前，對(duì)鈦金屬種植體的外表改性主要有兩種思路：外表物理形貌改性和生物化學(xué)組成改性。物理形貌改性即改變其外表形貌、微觀構(gòu)造、粗糙度等物理性質(zhì)。生物化學(xué)組成改性，即改變鈦金屬體的外表成分，比方在鈦種植體外表引入一些微量元素、生物活性涂層〔羥基磷灰石、氧化鈦等〕和膠原蛋白等生物活性因子，提高種植體外表的生物活性[2-3].研究表示清楚，骨組織中的無機(jī)成分主要是羥基磷灰石，因而具有良好的生物相容性[4-8].而膠原蛋白則是一種結(jié)晶纖維蛋白，是骨組織中最主要的有機(jī)成分。因而，將羥基磷灰石〔Hydroxyapatite,HA〕、膠原蛋白直接制備于鈦種植體外表構(gòu)成復(fù)合涂層，是提高鈦種植體臨床成功率的重要手段。本研究采用電化學(xué)沉積法[9-10]在鈦基板外表制備仿細(xì)胞外基質(zhì)涂層HA/膠原蛋白復(fù)合涂層，研究礦化膠原涂層作為生物涂層材料的可行性。1材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)材料選用2.0cm1.0cm0.1cm的純鈦片30片〔溫州鈦京生物科技有限公司，中國(guó)〕,用金相砂紙從1500目到4000目將其外表磨平，再用無水乙醇和去離子水超聲條件下清洗干凈，去除其外表的油污。分為實(shí)驗(yàn)組〔礦化膠原涂層〕、對(duì)照組〔純鈦片〕兩組備用。1.2電化學(xué)沉積法制備礦化膠原涂層1.2.1電解液的配置將Ⅰ型膠原牛跟腱〔河北考力森生物科技有限公司〕酶解在0.005mol/L的醋酸溶液〔國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司〕中，得到0.5mg/mL的膠原溶液；體積比以1∶1∶8配置80mmol/LCa〔NO3〕2、160mmol/LNH4H2PO4和膠原溶液電解液。1.2.2電化學(xué)沉積經(jīng)過利用Chi604c電化學(xué)工作站〔上海辰華儀器有限公司〕作為沉積設(shè)備，實(shí)驗(yàn)組采用雙電極電解沉積法，以鈦基板作工作電極，純鉑片作為陽極，兩電極間距固定值為2cm.整個(gè)電沉積經(jīng)過中沉積溫度利用恒溫水浴37℃反響容器進(jìn)行控制。電壓設(shè)定為2.6V,沉積時(shí)間為30min.采用控制電位電解庫(kù)侖法進(jìn)行電化學(xué)沉積，得到礦化膠原涂層。沉積結(jié)束后，能夠觀察到礦化膠原涂層會(huì)逐步附著在鈦金屬基板的外表上呈現(xiàn)凝膠形式，先用去離子水輕輕地沖洗涂層，洗去粘附其上的鈣離子等溶液中的離子，再將附有礦化膠原涂層的鈦金屬基板在空氣中水平地放置，使其自然枯燥，最終制備獲得具有礦化膠原涂層外表附著的鈦金屬基板。1.3生物學(xué)性能評(píng)價(jià)1.3.1礦化膠原涂層在模擬體液〔simulatedbodyfluid,SBF〕泡在含有7mL模擬體液的聚乙烯塑料離心管中。然后將試管置于37℃的恒溫箱中，分別震蕩浸泡3、7d,取出并用去離子水沖洗，自然風(fēng)干，華而不實(shí)隔天更換一次SBF溶液至7mL.樣品置于37℃的恒溫箱中保存，用于掃描電鏡〔SEM〕〔日立公司，日本〕觀察其外表礦化行為。1.3.2MTS法檢測(cè)細(xì)胞粘附及增殖用來做檢測(cè)的細(xì)胞采用從ATCC公司購(gòu)買的MC3T3-e1細(xì)胞，在37℃、5%CO2濃度條件下，使用含10%胎牛血清和1%抗生素〔青霉素和鏈霉素〕的DMEM培養(yǎng)基中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代待用。采用MTS法〔Promega,Madison,WI,G358B〕測(cè)定活性細(xì)胞數(shù)量，實(shí)驗(yàn)將MC3T3-e1培養(yǎng)于礦化膠原組及空白鈦基板外表，24、72h后分析細(xì)胞粘附、增殖情況。詳細(xì)步驟如下：細(xì)胞以2.5104個(gè)/cm2植入24孔板，在每個(gè)孔中參加0.5mL培養(yǎng)液。對(duì)于培養(yǎng)24h的樣品，先將培養(yǎng)液吸除，再用PBS將樣品清洗兩遍，然后參加0.5mL新的培養(yǎng)基和50LMTS液，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h;汲取120L的培養(yǎng)液至96孔板中，在Model680酶標(biāo)儀〔Bio-Rad,美國(guó)〕上測(cè)定吸光密度值〔OD值〕〔490nm波長(zhǎng)處〕.對(duì)于培養(yǎng)72h的試樣，則直接在原培養(yǎng)液中加50LMTS液，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移放置在37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,然后汲取120L至96孔板測(cè)定其OD值。1.3.3Western-Blotting法檢測(cè)細(xì)胞分化在放置1cm1cm大小純Ti組、礦化膠原涂層組的24孔板中以密度為2.5104個(gè)/cm2植入成骨前體細(xì)胞〔MC3T3-e1〕,每組試樣均為3塊。分別培養(yǎng)1周、2周后，提取蛋白并變性，采用SDS-聚丙烯酸胺凝膠法跑電泳及轉(zhuǎn)膜，將偏二氟乙烯〔polyvinylidene-fluoride,PVDF〕膜置于5%的脫脂奶粉中室溫封閉2h,一抗〔分別為甘油醛-3-脫氫酶GAPDH、堿性磷酸酶ALP、膠原蛋白COL-1〕4℃過夜作用，TBST搖床洗滌4~5次，參加適量二抗室溫孵育1h并洗滌數(shù)次，顯色液顯色作用后，于曝光儀〔Bio-Rad,美國(guó)〕內(nèi)密閉曝光并分析數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1礦化膠原涂層在SBF中的行為圖1顯示，通過在SBF中生物活性材料外表的礦化經(jīng)過觀察能夠初步估計(jì)其在實(shí)際植入體內(nèi)經(jīng)過中構(gòu)成羥基磷灰石骨性結(jié)合的能力。圖1顯示，SBF溶液中浸泡3d后，膠原涂層本來致密的構(gòu)造出現(xiàn)了礦化膠原束，涂層形貌上出現(xiàn)了一些微孔，這是由于有一部分涂層溶解導(dǎo)致；而經(jīng)過7d的模擬體液浸泡之后，能夠看到礦化膠原涂層發(fā)生了較為明顯的礦化。2.2礦化膠原涂層對(duì)細(xì)胞粘附、增殖的影響細(xì)胞培養(yǎng)1d并用PBS去除未貼壁細(xì)胞后顯示：實(shí)驗(yàn)組OD值大于純Ti組，兩者有顯著性差異，這證明了礦化膠原涂層能促進(jìn)植入初期細(xì)胞的附著；對(duì)72h細(xì)胞增殖培養(yǎng)后比擬表示清楚：礦化膠原組OD值大于純Ti組，兩者有顯著性差異，講明了礦化膠原涂層能促進(jìn)細(xì)胞的增殖〔圖2〕.2.3礦化膠原涂層對(duì)細(xì)胞分化的影響本實(shí)驗(yàn)通過Western-Blotting法比擬1周及2周各礦化膠原涂層外表的成骨前體細(xì)胞的ALP及COL-1表示出。華而不實(shí)培養(yǎng)1周后結(jié)果顯示：礦化膠原涂層ALP、COL-1表示出程度均高于純Ti涂層組，且結(jié)果具有顯著性差異，表示清楚礦化膠原涂層能加速成骨前體細(xì)胞的分化進(jìn)程；對(duì)2周后細(xì)胞分化相關(guān)因子檢測(cè)表示清楚：礦化膠原涂層及純Ti組ALP表示出水平基本無差異，而涂層組COL-1表示出水平均顯著高于純Ti組，但卻略低于一周組，涂層組已進(jìn)入分化晚期，明顯優(yōu)于純Ti組〔圖3〕.3討論隨著臨床應(yīng)用的日益廣泛，怎樣通過對(duì)鈦金屬外表進(jìn)行適宜的改性，有利于細(xì)胞組織，尤其是成骨樣細(xì)胞在其外表的附著生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)骨整合，是當(dāng)下提高鈦種植體臨床應(yīng)用效率的研究熱門。由于羥基磷灰石的構(gòu)造成分與天然骨組織特別類似，被包埋在含有鈣鹽的基質(zhì)中，使骨組織表現(xiàn)出良好的韌性，所以將其植入體內(nèi)后會(huì)與周圍的生物環(huán)境發(fā)生融合作用，且其外表會(huì)重新沉積一層類骨磷灰石。新生骨既能夠在羥基磷灰石外表生長(zhǎng)，可以以在周圍骨組織外表生長(zhǎng)，構(gòu)成雙向生長(zhǎng)。這種雙向生長(zhǎng)能夠促進(jìn)植入體與骨組織間構(gòu)成直接的化學(xué)鍵合，有利于植入體的骨結(jié)合。Wang等[12]研究表示清楚TiO2生物活性層能有效促進(jìn)HA/膠原復(fù)合涂層的制備。同時(shí)，在鈦種植體外表制備HA/膠原復(fù)合涂層，能夠顯著提高其生物活性，賦予其豐富的生物信號(hào)，加強(qiáng)其誘導(dǎo)和促進(jìn)骨組織生長(zhǎng)的功能。研究表示清楚，在體內(nèi)環(huán)境中由于成骨細(xì)胞本身就能夠分泌膠原蛋白，并與其他細(xì)胞協(xié)同作用，使膠原蛋白自組裝構(gòu)成有序的骨組織雛形。隨后，羥基磷灰石等無機(jī)鹽沉積上去，也就是我們所講的礦化經(jīng)過，最終構(gòu)成新的骨組織。由于骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白等有機(jī)成分和羥基磷灰石等無機(jī)成分構(gòu)成，在鈦種植體外表構(gòu)建出羥基磷灰石/膠原蛋白〔礦化〕復(fù)合涂層，肯定能促進(jìn)骨細(xì)胞的吸附、生長(zhǎng)以及增殖，而且還能夠增加其承載生物活性因子和藥物的能力[13-16].假如在鈦金屬植入體外表直接引入羥基磷灰石礦化的膠原蛋白，就能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物活性表示出，進(jìn)而大大的提高其骨結(jié)合的效率與效果。本文以能夠促進(jìn)骨修復(fù)及種植體骨整合為最終目的，從醫(yī)用鈦金屬、生物活性高分子膠原蛋白、生物活性陶瓷羥基磷灰石出發(fā)，采用電化學(xué)沉積的方式方法在具有多孔氧化層的鈦基板上沉積了膠原與羥基磷灰石的準(zhǔn)三維礦化膠原涂層，制備了一種同時(shí)具備三類生物材料優(yōu)勢(shì)的生物活性涂層。這種多孔的礦化膠原涂層不僅在成分上有利于成骨細(xì)胞的生物活性表示出，而且給細(xì)胞之間提供了互相連接的空間。這對(duì)細(xì)胞之間互相協(xié)同作用的通道表示出非常重要，也是該礦化膠原涂層表現(xiàn)出相對(duì)于純鈦金屬顯著更好的生物活性的一個(gè)重要原因。通過體外模擬環(huán)境驗(yàn)證基于該礦化膠原涂層的鈦種植體將大大加速植入體外表礦化進(jìn)程；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了礦化膠原涂層能顯著提高鈦植入體的生物活性，成骨前體細(xì)胞粘附效率得到了有效的提高并促進(jìn)了細(xì)胞增殖；同時(shí)，通過比擬不同礦化涂層及純Ti對(duì)于成骨前體細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，表示清楚礦化的膠原涂層可加速細(xì)胞分化進(jìn)程。在模擬液SBF中，礦化膠原涂層能穩(wěn)定存在并發(fā)生進(jìn)一步礦化，此礦化層同羥基磷灰石晶相類似，故將促進(jìn)種植體外表骨整合水平，改善植入體生物活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表示清楚礦化膠原涂層能加速成骨前體細(xì)胞的附著并促進(jìn)其增殖；同時(shí)，礦化膠原涂均能顯著加速成骨前體細(xì)胞的分化，其更快地表示出成骨分化初期細(xì)胞因子ALP及晚期指標(biāo)COL-1蛋白。故揣測(cè)涂層組富含膠原類蛋白，可被細(xì)胞外基質(zhì)所辨別，加速細(xì)胞的粘附及增殖，對(duì)于涂層組更快地進(jìn)入細(xì)胞初期分化進(jìn)程，原因可能在于其更快地到達(dá)了細(xì)胞