第六章 發(fā)酵液預(yù)處理及固液分離

第六章發(fā)酵液的預(yù)處理及固液分離四川理工生藥2011抗生素下游加工的一般過(guò)程1、發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離2、提?。撼恋?、吸附、萃取3、分離（精制：層析、離子交換）4、最后純化（成品加工：濃縮、結(jié)晶、干燥）第一節(jié)發(fā)酵液的性質(zhì)一、抗生素在發(fā)酵液中的存在部位存在部位２.細(xì)胞內(nèi)：積累于菌絲體內(nèi)，且水溶性?。ㄉ贁?shù)）１.細(xì)胞外：產(chǎn)生后被分泌到細(xì)胞外（多數(shù)）胞內(nèi)抗生素：②過(guò)濾→濾餅→提?、偌铀帷A等使其轉(zhuǎn)入細(xì)胞外二、抗生素的穩(wěn)定性抗生素需在適宜的溫度、pH值、壓力等條件下才穩(wěn)定。提取、分離等過(guò)程應(yīng)提供適宜的條件。eg.青霉素pH值4.8-5.2，低溫條件下才穩(wěn)定三、發(fā)酵液中的雜質(zhì)較多包括：２.可溶性：Pr.aa.金屬離子等萃取，分離，離子交換１.不溶性：菌絲體、剩余培養(yǎng)基等過(guò)濾除去第二節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理的方法一、發(fā)酵液預(yù)處理的目的１、固液分離：分離菌絲體、未用完培養(yǎng)基及其它代謝產(chǎn)物等，盡可能使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)工序處理的相中（多為液相）２、能夠除去部分雜質(zhì)：主要去除蛋白質(zhì)和金屬離子，減少后續(xù)處理的負(fù)荷。二、發(fā)酵液預(yù)處理的要求1、菌體分離發(fā)酵液中除發(fā)酵產(chǎn)物外，還含有大量的菌體，為方便提取和精制，首先要將菌體與發(fā)酵液分離。為保證離心和過(guò)濾順利進(jìn)行，要正確控制發(fā)酵終點(diǎn)。否則對(duì)目標(biāo)物的回收均不利。２、蛋白質(zhì)的去除發(fā)酵液中去除菌體和固體懸浮物后，一些可溶性蛋白質(zhì)仍留在濾液中，需設(shè)法去除。除去蛋白質(zhì)的濾液要保證在一定的pH范圍內(nèi)不發(fā)生混濁，否則影響溶媒提取和離子交換提取。３、重金屬離子的去除重金屬離子的存在，會(huì)影響提取和精制，同時(shí)會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和回收率，故必須除去。４、色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)的去除針對(duì)藥用發(fā)酵產(chǎn)品尤為重要。尤其是針劑。５、改變發(fā)酵液性質(zhì)，以利于提取和精制后續(xù)工序的操作順利進(jìn)行如，當(dāng)發(fā)酵終了時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物可能在發(fā)酵液中，也可以在菌體內(nèi)部或兩相同時(shí)存在。常采用調(diào)節(jié)pH、酸性或堿性的方法使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)處理的相中。６、調(diào)整適當(dāng)pH值和溫度避免引起產(chǎn)物的破壞和損失。多數(shù)抗生素不耐熱，對(duì)pH值要求高。三、蛋白質(zhì)的預(yù)處理（除雜蛋白）1．等電點(diǎn)沉淀2.變性沉淀3．加各種沉淀劑沉淀4．加入凝聚劑（金屬鹽）5．加入絮凝劑1．等電點(diǎn)沉淀調(diào)Ph到等電點(diǎn)，雜蛋白的凈電荷為零，溶解度最小，沉淀析出。多數(shù)抗生素發(fā)酵液的等電點(diǎn)4.0-5.5之間，一般加酸調(diào)。如：硫酸、鹽酸、磷酸等。2.變性沉淀（凝固）：①加熱，但多數(shù)抗生素不耐熱，只適用于熱穩(wěn)定抗生素。如：灰黃霉素②加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等3．加沉淀劑沉淀：對(duì)酸性發(fā)酵液：可加陰離子，如三氯乙酸，鞣酸等對(duì)堿性發(fā)酵液：可加陽(yáng)離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+等4．加入凝聚劑（金屬鹽）凝集劑的作用：粒子表面電荷中和；消除粒子表面穩(wěn)定的雙電荷層；使膠體粒子的排斥電位降低而發(fā)生聚沉。金屬鹽特別是重金屬鹽較常用。如，硫酸鋁、三氯化鐵等5．加入絮凝劑絮凝是指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成粗大絮凝團(tuán)的過(guò)程。近年較常用。如，殼聚糖、海藻酸鈉、明膠的等（帶有氨基、羧酸基等，電荷密度高。5．加入絮凝劑絮凝是指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成粗大絮凝團(tuán)的過(guò)程。近年較常用。如，殼聚糖、海藻酸鈉、明膠的等（帶有氨基、羧酸基等，電荷密度高。四、高價(jià)金屬離子的去除Ca2+：加入草酸鈉或草酸，生成的草酸鈣沉淀還能促使雜蛋白質(zhì)凝固，提高濾速和濾液質(zhì)量。Mg2+：草酸、磷酸鹽（在堿性條件下，生成磷酸鎂鹽沉淀）、三聚磷酸鈉。Fe3+：加入黃血鹽，形成普魯士藍(lán)沉淀。第三節(jié)發(fā)酵液的液固分離

一、固液分離的目的收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體，分離除去液相（胞內(nèi)抗生素）收集含生化物質(zhì)的液相，分離除去固體懸浮物如，細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等。（胞外抗生素）二、固液分離的要求濾液澄清—便于后續(xù)處理速度快－多數(shù)抗生素不穩(wěn)定三、影響固液分離的因素

１、微生物的種類(lèi)：①真菌：比較粗大,易過(guò)濾分離,通常不需特殊處理②放線(xiàn)菌:細(xì)而分枝(1um),較黏,較難.需處理—加助濾劑或蛋白絮凝劑③細(xì)菌:體積細(xì)小,過(guò)濾最難,可考慮離心２、菌體細(xì)胞:通常細(xì)胞破碎或細(xì)胞自溶后粘度增大。因此細(xì)胞破碎的程度應(yīng)控制，發(fā)酵放罐時(shí)間要適宜。3、培養(yǎng)基成分：如用黃豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都會(huì)升高。固液分離速度通常與粘度成反比，粘度越大，固液分離越困難。四、固液分離常用方法：過(guò)濾和離心

過(guò)濾：懸浮液通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)時(shí)固態(tài)顆粒與溶液分離。分為澄清過(guò)濾和濾餅過(guò)濾。

離心分離：在離心力場(chǎng)的作用下，將懸浮液中的固相與液相加以分離，多用于顆粒較小的懸浮液和乳濁液的分離。在某一支撐物上放過(guò)濾介質(zhì)，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過(guò)，固體顆粒留下。（一）過(guò)濾：過(guò)濾介質(zhì)filtermedium:過(guò)濾采用的多孔物質(zhì)；濾漿filterpulp:所處理的懸浮液；濾液filtrate:通過(guò)多孔通道的液體；濾餅或?yàn)V渣filtercake:被截留的固體物質(zhì)。1）常規(guī)過(guò)濾：料液流動(dòng)方向與過(guò)濾介質(zhì)垂直。通常適于過(guò)濾直徑較大的懸浮粒子。如放線(xiàn)菌、霉菌發(fā)酵液。對(duì)細(xì)小菌體或黏度較大的發(fā)酵液，需使用助濾劑。2）濾餅過(guò)濾：當(dāng)懸浮液通過(guò)濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。在濾餅過(guò)濾中，當(dāng)濾餅至一定厚度時(shí)即起主要的過(guò)濾作用適合于固體含量大于0.1%的懸浮液的過(guò)濾分離。1、過(guò)濾分類(lèi)3）錯(cuò)流過(guò)濾：又稱(chēng)切向流過(guò)濾（Cross-FlowFiltration）傳統(tǒng)過(guò)濾時(shí)過(guò)濾液體垂直于過(guò)濾介質(zhì)，過(guò)濾阻力主要來(lái)之濾餅。錯(cuò)流過(guò)濾打破了傳統(tǒng)過(guò)濾的機(jī)制，即液體的流向和濾膜相切。在壓力推動(dòng)下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內(nèi)壁作切向流動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切作用將過(guò)濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定不變的過(guò)濾速度2、過(guò)濾介質(zhì)選擇過(guò)濾介質(zhì)起過(guò)濾作用，還是濾餅的支撐物。應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和盡可能小的流動(dòng)阻力。合理選擇過(guò)濾介質(zhì)：過(guò)濾介質(zhì)所能截留的固體粒子大?。和ǔＲ赃^(guò)濾介質(zhì)的孔徑表示。常用的過(guò)濾介質(zhì)中，纖維濾布所能截留的最小粒子約10μm，硅藻土為lμm，超濾膜可小于0.5μm。發(fā)酵液中懸浮離子的大小過(guò)濾介質(zhì)的種類(lèi)1、織物介質(zhì)2、粒狀介質(zhì)3、多孔固體介質(zhì)4、微孔纖維素薄膜和金屬薄膜介質(zhì)1）織物介質(zhì)又稱(chēng)濾布，應(yīng)用最廣泛，包括由棉、麻等天然纖維濾布和合成纖維濾布。其過(guò)濾性能受許多因素的影響，其中最重要的是纖維的特性、編織紋法和線(xiàn)型。2）粒狀介質(zhì)有硅藻土、珍珠巖粉、細(xì)砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是優(yōu)良的過(guò)濾介質(zhì)：①一般不與酸堿反應(yīng)，化學(xué)性能穩(wěn)定；②形狀不規(guī)則，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；③無(wú)毒且不可壓縮，形成的過(guò)濾層阻力不隨操作壓力變化。3）多孔固體介質(zhì)

如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板狀或管狀，孔隙很小且耐腐蝕，常用于過(guò)濾含有少量微粒的懸浮液。4）微孔纖維素薄膜和金屬薄膜介質(zhì)典型過(guò)濾設(shè)備：按操作方式分類(lèi)：間歇過(guò)濾機(jī)、連續(xù)過(guò)濾機(jī)按操作壓強(qiáng)差分類(lèi)：壓濾、吸濾和離心過(guò)濾實(shí)驗(yàn)室用抽濾裝置板框壓濾機(jī)（間歇操作）轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)（連續(xù)操作）過(guò)濾式離心機(jī)3、過(guò)濾設(shè)備1）實(shí)驗(yàn)室用抽濾裝置2）板框壓濾機(jī)

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板框壓濾機(jī)的過(guò)濾推動(dòng)力來(lái)自泵產(chǎn)生的液壓或進(jìn)料貯槽中的氣壓。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過(guò)濾及霉菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。33板框壓濾機(jī)包括板和框，多做成正方形，角端均開(kāi)有小孔，裝合壓緊后即構(gòu)成供濾漿或洗水流通的孔道?？虻膬蓚?cè)覆以濾布，空框與濾布圍成了容納濾漿及濾餅的空間，濾板用以支撐濾布并提供濾液流出的通道。優(yōu)點(diǎn)過(guò)濾面積大，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低，動(dòng)力消耗少，對(duì)不同過(guò)濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)。它最重要的特征是通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的壓力降可以超過(guò)0.1MPa,這是真空過(guò)濾器無(wú)法達(dá)到的。缺點(diǎn)不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非過(guò)濾的輔助時(shí)間較長(zhǎng)。3）轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)是一種應(yīng)用較為廣泛的連續(xù)操作過(guò)濾設(shè)備，其主體是一個(gè)能轉(zhuǎn)動(dòng)的水平圓筒，圓筒表面裝有金屬網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布，圓筒的下端浸入濾漿。優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)可吸濾、洗滌、卸餅、再生連續(xù)化操作，生產(chǎn)能力大，勞動(dòng)強(qiáng)度小缺點(diǎn)：輔助設(shè)備多，投資大，且由于真空過(guò)濾，推動(dòng)力?。ú怀^(guò)8×104Pa），濾餅濕度大（20％～30％）。主要適用霉菌發(fā)酵液，對(duì)菌體細(xì)小、黏度大鋪助濾劑。對(duì)于濾餅阻力較大的物料適應(yīng)能力較差。39結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)鼓濾餅濾布濾網(wǎng)離心過(guò)濾機(jī)工作原理圖轉(zhuǎn)鼓(上有小孔，亦稱(chēng)懸框)；濾網(wǎng)；濾布；機(jī)架。原理：

由于離心力作用，液體產(chǎn)生徑向壓差，通過(guò)濾餅、濾網(wǎng)及濾筐而流出。4）離心過(guò)濾機(jī)（二）離心分離對(duì)于濃度較小，粒徑較大，硬度較強(qiáng)的不溶物，可以采用過(guò)濾分離。優(yōu)點(diǎn)：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好缺點(diǎn)：與過(guò)濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高；能耗大；離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過(guò)濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過(guò)濾可獲得的水分含量較低的濾餅。41按速度和離心力：1、常速離心機(jī)

最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),相對(duì)離心力(RCF)104g以下,用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)确蛛x；2、高速（冷凍）離心機(jī)

1×104-2.5×104rpm，相對(duì)離心力104~105g,用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機(jī)

轉(zhuǎn)速2.5-8×104rpm，相對(duì)離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測(cè)純度；沉降系數(shù)和相對(duì)分子量測(cè)定等。離心機(jī)的種類(lèi)與用途按離心機(jī)的作用方式：斜角式平拋式管式蝶式螺旋式多室431）斜角式離心機(jī)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室常用離心機(jī)指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；

角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差2）平拋式離心機(jī)平拋式離心機(jī)一類(lèi)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室常用的低中速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，靜止時(shí)垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動(dòng)。樣品便于收集，受振